Een team van onderzoekers onder leiding van Dr. Mike Sleutel van het VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie in samenwerking met wetenschappers van het Instituut voor Complexe Moleculaire Systemen van de Technische Universiteit Eindhoven, en het CNRS in Grenoble, hebben voor het eerst de moleculaire details van eiwitkristalkiemvorming blootgelegd, een proces met grote medische en wetenschappelijke relevantie. Het team ontwikkelde ook een nieuwe methodologie om een ​​brede klasse van systemen te bestuderen die tot op heden ongrijpbaar zijn gebleven. Hun resultaten zijn gepubliceerd in Natuur .

Dr. Mike Sleutel (VIB-VUB):"Het zal opwindend zijn om te zien dat deze nieuwe techniek in de toekomst wordt toegepast om de zelfassemblageprocessen van eiwitten te volgen die betrokken zijn bij een reeks pathologische aandoeningen, zoals vloeistof-vloeistof fasescheiding bij oogstaarvorming of de vorming van amyloïde vezels geassocieerd met een reeks neurologische aandoeningen."

Eiwitkristallen hebben een grote medische en wetenschappelijke relevantie. Al decenia, ze zijn essentieel geweest voor structurele biologen om de driedimensionale structuren van eiwitten op te lossen, maar eiwitkristallen worden ook gebruikt als biofarmaceutische afgiftemiddelen. Kristallijne suspensies zijn aantrekkelijke formuleringen om actieve farmaceutische verbindingen op te slaan en toe te dienen vanwege hun lange houdbaarheid, lage viscositeit van het oplosmiddel, en langzame oplossnelheid. Misschien wel het bekendste voorbeeld is insuline:insuline-injecties omvatten de subcutane injectie van een suspensie van insuline-microkristallen die langzaam oplossen om in de loop van de tijd een gestage en aanhoudende afgifte te geven. Ondanks hun enorme potentieel, er zijn twee factoren die het gebruik van eiwitkristallen in een breed scala aan toepassingen beperken.

Uitdagingen bij het ontwikkelen van eiwitkristallen

Eerst, groeiende eiwitkristallen, zoals veel moleculair biologen zullen zeggen, is meer een kunst dan een wetenschap. In feite, voor veel eiwitten, kristallisatie kan ondraaglijk moeilijk zijn. Dit volgt gedeeltelijk uit het feit dat wetenschappers de vroege stadia van eiwitkristalvorming niet begrijpen. Elk kristal is afkomstig uit een kern, een klein kristallijn zaadje, die zich vormt door de spontane groepering van een paar moleculen in oplossing die een regelmatige organisatie in drie dimensies moeten aannemen. Hoe de moleculen deze onwaarschijnlijke prestatie realiseren, is tot nu toe een mysterie gebleven.

Ten tweede, een enkel eiwit kan kristalliseren in meerdere verschillende kristalvormen, dit staat bekend als polymorfisme. Verschillende kristalpolymorfen hebben verschillende kenmerken, met de meest opvallende de kracht om röntgenstralen te buigen (cruciaal voor de bepaling van de 3D-structuur), en de snelheid waarmee het oplost (cruciaal voor medicijnafgifte). Tot nu toe, het is erg moeilijk om het kristallisatieproces naar de polymorf van je smaak te leiden. Wetenschappers geloven dat polymorfe selectie plaatsvindt in het stadium van nucleatie, maar niemand weet precies hoe het mechanisme werkt.

Een nieuwe manier om naar de zelfassemblage van macromoleculen te kijken

De groep wetenschappers onder leiding van Dr. Mike Sleutel heeft ultramoderne cryotransmissie-elektronenmicroscopie (Cryo-TEM) gebruikt om de geboorte van een eiwitkristal vast te leggen door het proces van kiemvorming in moleculaire resolutie te visualiseren.

Dr. Heiner Friedrich legt uit:"Omdat het proces zo snel gaat, en op zo'n kleine lengteschaal moesten we het monster in verschillende stadia van het proces cryogeen stoppen. Eenmaal bevroren in de tijd, we gebruiken een zeer gevoelige elektronenmicroscoop om de eiwitten te visualiseren en hoe ze zich groeperen om een ​​kern en uiteindelijk het eiwitkristal te vormen."

Door de Cryo-TEM-beelden te analyseren die zijn genomen uit een reeks monsters met constante tijdsintervallen, ze zouden de reeks moleculaire botsingen kunnen gaan puzzelen die moeten plaatsvinden om een ​​kristallijne kern te vormen. Dr. Mike Sleutel vervolgt:"We werden getroffen door de onverwachte complexiteit van het proces, die veel ingewikkelder bleek te zijn dan de werkmodellen die wij en anderen in het veld hadden voorafgaand aan deze waarnemingen. Voor het eiwit dat we in onze studie gebruikten, ontdekten we een hiërarchisch zelfassemblageproces dat drie opeenvolgende stadia van zelfassemblage omvat op steeds grotere lengteschalen." Deze waarnemingen zijn de eerste in hun soort en bieden een nieuwe manier om naar de zelfassemblageprocessen van macromoleculen tot grotere structuren.

Maar het team ging nog een stap verder, en vergeleek de nucleatieroutes van meerdere polymorfen. Ze toonden aan dat polymorfe selectie wordt bepaald door de architectuur van de kleinst mogelijke fragmenten die op vroege tijdstippen zijn gevormd. Zodra dergelijke structuren zijn gevormd, het vertrouwen van het systeem is ingesteld. Dr. Alexander Van Driessche legt uit:"Door de verschillen in structuur van de verschillende kernen te analyseren en te begrijpen, we hebben strategieën ontwikkeld om het selectieproces van polymorfen te begeleiden. We hebben dit bereikt door voorzichtig de verschillende manieren van interactie tussen de moleculen aan te passen, het nucleatieproces in de richting van onze keuze sturen." Het team is van mening dat de nieuwe inzichten en methodologie de ontwikkeling van eiwitkristallen voor 3D-structuurbepaling en medische toepassingen aanzienlijk zullen bevorderen.