Gedurende twee weken in 2004, Song Zhiwei was getuige van de langzame dood van een kolonie cellen. Liedje, een bio-ingenieur bij het A*STAR Bioprocessing Technology Institute (BTI), een bord met ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO) had gebaad met lectine, een toxisch eiwit afkomstig van planten. Vervolgens zag hij de miljoenen cellen krimpen tot een dozijn overlevenden. Ze zagen er gemiddeld uit, maar Song wist dat ze superkrachten hadden. Het geheim zat verborgen in de zoetstof.

Suikers zijn essentieel voor het leven. Tot de belangrijkste suikers behoren de suikers die chemisch aan eiwitten zijn gebonden. Deze glycoproteïnen zijn bij alles betrokken, van het herkennen van indringers van het immuunsysteem tot het smeren van membranen en het stimuleren van de schildklier. Ze voeden ook een bloeiende farmaceutische industrie - veel huishoudelijke medicijnen bevatten glycoproteïnen, en biotechbedrijven investeren aanzienlijke middelen in het optimaliseren van de versuikering van deze eiwitten om hun bioactiviteit en therapeutische potentie te verbeteren.

Van lectine is bekend dat het zich bindt aan suikers die aan de uiteinden van glycoproteïnen bungelen. In het experiment van Song, alleen mutante CHO-cellen die die bindende suikers niet produceerden, konden de lectinebehandeling overleven. Deze benadering van 'zien wat plakt' is een gevestigde methode om mutanten te identificeren die vervolgens in massaproductie kunnen worden genomen door de biotech-industrie.

Song bracht de volgende twee jaar door met het uitvoeren van celkweekexperimenten, moleculaire biologiestudies en genetische tests om te bewijzen dat de cellen eigenlijk mutanten waren. Het bepalen van de exacte structuur van de gemuteerde glycoproteïnen vereiste hulp van zijn collega Lee May May, die aan het hoofd stond van de analysegroep bij BTI. May gebruikte massaspectrometrie-instrumenten om de exacte biochemische structuur te bepalen van de eiwitten geproduceerd door de gemuteerde cellen van Song, onthullend dat ze belangrijke suikers misten. Song had de eerste suikermutantcellijnen gemaakt die van toepassing zijn op biotechproductie.

De samenwerking is sindsdien uitgegroeid tot een wereldwijd gerenommeerd partnerschap tussen bio-ingenieurs en bio-analisten bij A*STAR, het bevorderen van het begrip van de rol van suikers bij ziekten.

Lief gepraat

Suikers zijn de kleinste en eenvoudigste vorm van koolhydraten, gemaakt van enkele of verbonden moleculaire eenheden van koolstof, waterstof en zuurstof. Ons bloed bevat honderden soorten suikers:sommige zweven vrij rond, maar veel meer gehecht aan eiwitten zoals versieringen op een kerstboom. Bijna 70 procent van de eiwitten in ons lichaam is geglycosyleerd, wat betekent dat ze niet zullen functioneren zonder hun zoete uitrusting. De specifieke regeling van suikers, of glycanen, op een glycoproteïne bepaalt hoe een eiwit vouwt en interageert met andere moleculen, verandert de oplosbaarheid en soms zelfs de berichten die het naar cellen verzendt. "De cel verbruikt enorm veel energie om suikers op eiwitten te zetten, " zegt Pauline Rudd, een veteraan op het gebied van glycobiologie, die in 2015 bij het BTI-analyseteam kwam. "Als je geen suikers had, je zou het niet overleven."

Onderzoekers ontdekten voor het eerst de cruciale rol van glycoproteïnen in de vroege jaren 1900. Een Oostenrijkse arts, Karl Landsteiner, merkte op dat mensenbloed zich vermengde met het bloed van dieren, of zelfs andere mensen, vormt klonten. Deze klonten kunnen bloedvaten verstoppen of openbarsten om giftige eiwitten in het lichaam vrij te geven. Echter, Landsteiner merkte op dat sommige mengsels niet stolden. Deze ontdekking leidde hem naar de bloedgroepclassificatie die vandaag nog steeds wordt gebruikt - A, B, AB en O - en wonnen hem in 1930 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde. In de jaren vijftig bepaalden onderzoekers dat de suikers die aan het oppervlak van rode bloedcellen werden blootgesteld, bepaalden tot welke bloedgroep ze behoorden.

Het bloedonderzoek stimuleerde onderzoek naar glycoproteïnen. Tegen de jaren negentig, biologen raakten verstrikt in de genetica-rage. De remedie voor alles, zij stelden, zat verstopt in ons DNA. "Van genen werd beweerd dat ze de oorzaak waren van alles, " zegt Ruud, die de financiering voor glycobiologie zagen afnemen. Tussen 1998 en 2000, Er is wereldwijd $ 3,5 miljard uitgegeven aan genomics-onderzoek, inclusief het initiatief om het hele menselijke genoom te sequensen. "Er was veel informatie, maar het gaf ons geen directe route om ziekte te begrijpen, " zegt Rudd. "Mensen begonnen te suggereren dat genen misschien niets anders doen dan coderen voor eiwitten."

Wetenschappers verlegden hun aandacht naar de vele andere stadia van biologische activiteit totdat ze weer bij suikers kwamen.

"DNA is de eerste informatielaag. Deze informatie wordt getranscribeerd in RNA, die een bericht verzendt dat wordt vertaald in een eiwit met een functie, " zegt Song. "Koolhydraten, of suikers, zijn de laatste laag biologische informatie."

Het kennen van het belang van suikers maakte het er niet gemakkelijker op om ze te bestuderen. DNA en eiwitten zijn in wezen lineaire structuren die "opkrullen tot mooie vormen, " zegt Rudd. Suikers vertakken zich in meerdere ketens. "Het zijn als grote bomen die aan de zijkanten van eiwitten hangen." Het zou enkele jaren duren voordat suikers konden worden geanalyseerd met de precisie en snelheid van genen en eiwitten.

Opschudden

In 1989 trof een aardbeving Californië. Rudd herinnert het zich nog goed. Ze was nauw betrokken bij een samenwerking tussen het Oxford Glycobiology Institute (onder leiding van directeur Raymond Dwek) en een onderzoeksteam in Londen, op zoek naar veranderingen in de manier waarop eiwitten worden geglycosyleerd bij patiënten met auto-immuunziekten. Ze analyseerde 600 monsters van het immunoglobuline G (IgG) eiwit, met een speciale gel om de suikers te filteren. De fabriek die deze gel produceerde, werd verwoest door de aardbeving.

Toen de fabriek werd herbouwd, de gel was niet hetzelfde. "Het was volkomen nutteloos, " herinnert zich Rudd. "Ik was mijn haar aan het uittrekken om deze 600 monsters te laten analyseren."

Noodzaak kweekt uitvinding, dus Rudd keek om zich heen en zag de vloeistofchromatografiekolommen (LC) die ze had gebruikt om eiwitten te sorteren. Ze stopte een spuit gevuld met een mengsel van suikers die vrijkwamen uit haar glycoproteïnemonsters in de kolommen. Het LC-apparaat filterde de suikers tot een veel hogere resolutie dan het gelproces. "We gingen nooit meer terug, " ze zegt.

Vanaf dat moment, Rudd heeft samengewerkt met particuliere en institutionele partners om te versnellen, automatiseren en verbeteren van de specificiteit van technieken voor het sorteren en karakteriseren van suikers uit een monster. Wat vroeger een jaar duurde, kan nu in een dag worden gedaan. De werkstroom, bioinformatica en databases ontwikkeld door Rudd's team van het National Institute for Bioprocessing Research and Training (Dublin, Ierland) zijn opgenomen in het UNIFI analytische gekoppelde vloeistofchromatografie/massaspectrometrieplatform van Waters Corporation, wat betekent dat veel van de complexiteit van glycoanalyse nu is geautomatiseerd. Vandaar, glycoanalyse is een nieuw tijdperk van glycomics ingegaan, het dichter bij het big-data-universum van genetica brengen, transcriptomics en proteomics.

"We kunnen nu naar grote cohorten monsters kijken om meer te begrijpen over ziekten en om biologische ontwikkeling en productie te ondersteunen, " zegt Terry Nguyen-Khuong, die aan het hoofd staat van de analysegroep bij BTI. Sinds de samenwerking met Rudd, A*STAR heeft zijn analyseportfolio uitgebreid om in te zoomen op suikers en hun exacte locatie te identificeren, basisbouwstenen en verbindingsstructuren.

Pharming glycoproteïnen

Glycoproteïnen voeden een biofarmaceutische industrie van 163 miljard dollar waarvan de werkzaamheid kan worden bepaald door suikers. Bijvoorbeeld, wanneer het hormoon erytropoëtine is versierd met siaalzuursuikers, het is tien keer effectiever in het stimuleren van de productie van rode bloedcellen bij anemische patiënten dan het hormoon alleen.

In de glycoproteïne-business, CHO-cellen omvatten het volledige personeelsbestand. Ze kunnen alle eiwitten produceren die de biotech-industrie nodig heeft, en kan de eiwitten op dezelfde manier als mensen omhullen.

Voordat Song zijn eerste CHO-celmutanten creëerde, niemand was in staat geweest om de glycosylering van eiwitten in massaproduceerbare cellijnen te controleren. De groep van Pamela Stanley in de Verenigde Staten had jarenlang de glycosylering van CHO-cellen aangepast met behulp van cellijnen die leefden en stierven op een platte petrischaal, gevoed met eiwitrijk koeienbloed. Song ontwikkelde in plaats daarvan mutanten met behulp van cellen waarvan hij wist dat ze voor onbepaalde tijd konden repliceren terwijl ze ronddraaiden in sferische 20, Bioreactoren van 000 liter gebruikt in biofarmaceutische fabrieken - vrij van toevoegingen aan runderen.

Hij noemde de cellijn CHO-glycosylatiemutant 1 (GMT-1), en sinds toen, meer dan twintig opvolgers zijn in numerieke volgorde gevolgd. Toen er tools ontstonden die het bewerken van genen net zo eenvoudig maakten als het knippen en plakken van woorden op een computerscherm, hij gebruikte ze om meer mutanten te genereren.

In GMT-3, hij verwijderde een gen dat nodig is om fucose-suikers aan eiwitten te fixeren. GMT-9-glycoproteïnen missen de suikers fucose en galactose; en GMT-17 mist fucose, galactose en siaalzuur. De afwezigheid van deze suikers kan de potentie van medicijnen dicteren. Song's cellen produceren antilichamen die tot honderd keer beter zijn in het doden van kankercellen dan hun equivalente medicijnen op de markt, zoals rituximab (met het merk Rituxan) om leukemie te behandelen. "De cellijnen zijn vergelijkbaar met industriële lijnen en zijn klaar voor commercialisering, " zegt Lied, die sinds 2014 een GlycoSing-beurs van S$11 miljoen beheert, genaamd GlycoSing. Behandelingen met deze verbeterde antilichamen zouden aanzienlijk lagere doses betekenen.

In 2008, Andre Choo, een onderzoeker bij BTI, ontwikkelde de eerste antilichamen die specifiek embryonale stamcellen konden doden, het verlichten van zorgen over de cellen die tumoren vormen bij transplantatiepatiënten. De antilichamen zijn inmiddels in licentie gegeven aan verschillende bedrijven.

Veel ziekten hebben een duidelijk suikerprofiel, een concept dat Choo is gaan gebruiken voor kankertherapieën. Hij screent op antilichamen die specifiek gericht zijn op afwijkende suikermoleculen op het oppervlak van kankercellen, werken met het team van Rudd en Nguyen-Khuong om ze te analyseren.

Onlangs dit jaar, zijn team genereerde een antilichaam dat suikers herkent die tot expressie worden gebracht op eierstokkankercellen. "In het verleden zouden we een antilichaam genereren zonder echt te weten waar het op gericht was, we zijn nu gefocust op het proberen om deze anti-glycan-antilichamen te krijgen."

Bij A*STAR, onderzoek is uitgebreid naar dengue, het Zika-virus en hartziekten. "Alle belangrijke gebieden in de geneeskunde - kanker, infectieziekte en ontstekingsproblemen - zijn gerelateerd aan glycoproteïnen, " zegt Lied, waarvan de mutanten deze ziekten mogelijk kunnen genezen.