Het analyseren van DNA is nuttig voor een aantal vitale toepassingen. Dit omvat diagnose en monitoring van ziekten, identificatie van criminelen, en het bestuderen van de functie van een gericht DNA-segment. Echter, methoden die voor analyses worden gebruikt, vereisen vaak meer DNA dan in een typisch monster beschikbaar is. 'Daarom, versterking is nodig, maar niet altijd direct. De meest gebruikte amplificatie- of fotokopieermethode is de polymerasekettingreactie (PCR). Een nieuwe PCR-methode zou het amplificatieproces kunnen helpen, en zo robuuste testen te ontwikkelen die voorheen niet mogelijk zouden zijn geweest.

Deoxyribonucleïnezuur (DNA) is een molecuul dat in de celkern wordt aangetroffen en dat de 'instructies' bevat voor de ontwikkeling en het functioneren van levende organismen. Het wordt vaak vergeleken met een set blauwdrukken, omdat het de instructies bevat die nodig zijn om cellen te bouwen. Deze instructies zijn verdeeld in segmenten langs een DNA-streng.

Replicatie

DNA is opgebouwd uit een dubbele helix van twee complementaire strengen gemaakt van nucleotiden, een constructie die vaak wordt vergeleken met een ladder. Wanneer het tijd is om te repliceren, de twee DNA-strengen - of 'zijkanten' van de ladder - ontspannen zich en scheiden zich. Een enzym genaamd DNA-polymerase leest de individuele strengen en matcht complementaire basen - de 'sporten' van de ladder - met de originele streng. Nieuwe strengen worden geproduceerd aan beide zijden van het oorspronkelijke DNA, het maken van twee identieke dubbele DNA-helices bestaande uit een originele en een nieuwe streng. Dit proces vindt plaats in alle levende organismen en vormt de basis voor biologische overerving.

PCR

Replicatie kan ook kunstmatig worden verwerkt. Soms "moleculair fotokopiëren" genoemd, " de polymerasekettingreactie (PCR) is een snelle en relatief goedkope techniek die wordt gebruikt om, of maak veel kopieën van, kleine stukjes DNA. Dit is nodig omdat methoden die worden gebruikt voor het analyseren van DNA of het bepalen van de DNA-basenpaarsequentie meer DNA vereisen dan in een typisch monster kan zijn. Vandaar, het doel van PCR is om een ​​specifiek gebied van een DNA-streng te amplificeren.

Om PCR uit te voeren, de twee strengen van de dubbele DNA-helix worden fysiek gescheiden door toepassing van hoge temperatuur (93-98 ° C) in een proces dat DNA-smelten wordt genoemd. In de tweede stap, de temperatuur wordt verlaagd en de twee DNA-strengen, nu gescheiden, worden sjablonen voor zogenaamde primers. Primers zijn korte enkelstrengs DNA-moleculen, complementair aan het DNA-gebied waarop amplificatie is gericht. Na het verlagen van de temperatuur, de aan het PCR-proces toegevoegde primers vinden en binden aan zijn specifieke doelwit. Een enzym genaamd DNA-polymerase zal een nieuwe DNA-streng uit de primer verlengen - of bouwen - met behulp van het onderliggende enkelstrengige DNA-molecuul als sjabloon.

Een ladder bouwen

Zoals hierboven vermeld, primers zijn korte enkelstrengige DNA-moleculen. Deze zijn meestal ongeveer 20 nucleotiden lang. Deze reeks nucleotiden, hecht zich specifiek aan het begin van de sjabloonstreng door basenparing - het vinden van de complementaire basen. DNA-polymerase kan dan het volgende complementaire nucleotide toevoegen. Het polymerase gaat door met het toevoegen van meer complementaire nucleotiden aan het matrijs-DNA totdat een nieuwe dubbele DNA-streng is voltooid, of om de metafoor hierboven te gebruiken; er wordt een nieuwe ladder gebouwd, met één originele kant en één nieuwe kant.

Dubbele primers maken het mogelijk om het gebied van een DNA-molecuul dat door de PCR moet worden geamplificeerd, nauwkeurig te definiëren. Deze twee flankerende primers geven aan waar de nieuwe keten moet beginnen en eindigen.

Een kleine paradigmaverschuiving

Een centrale regel die sterk verankerd is in de geest van de moleculaire wetenschapper is dat primers alleen complementair moeten zijn aan de doelsequentie, en niet met elkaar. Dit om te voorkomen dat primers elkaar als sjablonen gebruiken en zo verdere mogelijke betrokkenheid bij traditionele doelamplificatie uit te schakelen.

In een recente studie, gepubliceerd in het wetenschappelijke tijdschrift PLOS One , Senior onderzoekswetenschapper Marc Anglès d'Auriac van het Noorse Instituut voor Wateronderzoek (NIVA) toont aan dat het mogelijk is om zeer complementaire primers te gebruiken en toch de hierboven genoemde ongelukkige gevolgen te vermijden. De nieuwe methode heeft de naam COMPAS-PCR gekregen, afkorting voor COMplementary Primer Asymmetrische PCR.

Kortom, Anglès d'Auriac merkte op dat primers die complementair zijn tussen zichzelf en een doelwit (drievoudige overlay) nog steeds een amplificatieproduct kunnen definiëren als ze deel uitmaken van een herhaald DNA-motief of -structuur. Dit is weergegeven in onderstaande figuur. Verder, de fysieke belemmering van doelamplificatie als gevolg van primer-complementariteit werd verlicht door het introduceren van asymmetrische primerconcentraties. Asymmetrisch betekent in dit opzicht oneven aantallen moleculen tussen de twee primers. Eén primer bestaat uit een laag aantal moleculen, de andere met een hoog nummer.

"Als je gelijke concentraties gebruikt, zoals u gewoonlijk doet voor PCR, de inleidingen, aanwezig in gelijke hoeveelheden, aan elkaar blijven plakken, ' zegt Anglès d'Auriac.

"Met asymmetrische concentraties, de overtollige of hooggeconcentreerde primer heeft een aantal moleculen die niet vastzitten aan de beperkende primer, en is daarom beschikbaar voor doelversterking."

Alleen werken

"Deze contra-intuïtieve benadering zal isoleren, maar ook beschermen, de lage concentratie primer, ' zegt Anglès d'Auriac.

Met de beperkende primer vast, en dus beschermd, het is mogelijk dat de primer met hoge concentratie alleen werkt, dat is, maak een enkelstrengs kopie van het DNA-doelwit. Als er voldoende enkelstrengige amplicons worden geproduceerd, ze kunnen dienen als sjabloonmateriaal voor de primer met lage concentratie. De beperkende primer komt vrij, en de reactie schakelt over naar klassieke exponentiële PCR-amplificatie.

"Dit vergroot de toepassingsmogelijkheden van PCR voor de wetenschapper, Anglès d'Auriac verduidelijkt."

Repetitieve structuren

In veel organismen een aanzienlijk deel van het genomische DNA is zeer repetitief, met meer dan de helft van de reeks bestaande uit repetitieve elementen bij mensen.

Het was inderdaad een zich herhalende DNA-structuur die ervoor zorgde dat Anglès d'Auriac buiten de gebaande paden ging denken en het COMPAS-PCR-principe naar voren bracht, een kleine paradigmaverschuiving op het gebied van moleculair fotokopiëren.

Tijdens het uitvoeren van op DNA gebaseerde diagnose voor zalmachtigen, met name identificatie van de nauw verwante beekforel (Salmo trutta) en Atlantische zalm (Salmo salar), Anglès d'Auriac worstelde om deze soorten te scheiden - inclusief hybriden tussen hen. Snelle en nauwkeurige identificatie zou de monitoring en studies van rivierecosystemen helpen verbeteren, aangezien de identificatie van hybriden belangrijk is om de ecologische gezondheid van stroomgebieden in te schatten. Na gebruik van COMPAS-PCR, Anglès d'Auriac was in staat om een ​​PCR-productanalysemethode toe te passen, de zogenaamde smeltanalyse met hoge resolutie, voor het identificeren van bruine forel, Atlantische zalm en hun hybriden in één test.

Anglès d'Auriac benadrukt echter dat het COMPAS-PCR-principe niet beperkt is tot de identificatie van vissoorten. Het gebruik van bijna volledig complementaire primers die op dezelfde sequentie zijn gericht, kan van toepassing zijn op alle kopieën die naast elkaar liggen, in DNA-motieven van belang als doelsequenties.

"Van DNA-herhalingssequenties wordt gerapporteerd dat ze meer dan 50% van het menselijk genoom omvatten en zijn aanwezig in veel "huishoudelijke" genfamilies, zoals het 5S-ribosomale gen dat in deze studie wordt gebruikt. de algemene COMPAS-PCR-principes zullen helpen bij het ontwikkelen van nieuwe DNA-amplificatiestrategieën die profiteren van deze herhaalde DNA-structuren, " Marc Anglès d'Auriac besluit.