Gelelektroforese is een veelgebruikte laboratoriumtechniek met veel praktische toepassingen, waaronder DNA-fingerprinting en genoomsequencing. Het proces omvat het scheiden van DNA-fragmenten met behulp van een elektrische stroom terwijl de snelheid van moleculaire beweging door een filtergel wordt gevolgd.

Door blauwe of oranje volgkleurstof aan kleurloze DNA-monsters toe te voegen, kunt u uw monster bekijken en informatie verkrijgen over hoe DNA moleculen bewegen tijdens elektroforese. Identificatie is gebaseerd op de grootte van DNA-banden op de gel na migratie van moleculen.
Hoe gelelektroforese werkt

Gelelektroforese trekt DNA-fragmenten door een gel met behulp van een elektrische stroom om DNA-moleculen op grootte te isoleren en te identificeren en elektrische lading. De gel wordt vaak gemaakt met agarose poeder
- een polysacharide geëxtraheerd uit zeewier.

Agarose wordt toegevoegd aan een bufferoplossing van water en zout, en het mengsel wordt verwarmd en gekoeld om een poreus te maken gel die zal fungeren als een filtermatrix tijdens de elektroforese procedure. De gel wordt vervolgens in een elektroforese-eenheid geplaatst en bedekt met een bufferoplossing die elektriciteit geleidt.

Oplossingen die DNA bevatten en kleurstoffen laden worden in kleine putjes in de gel gepipetteerd die tijdens de bereiding van de gel moeten worden gemaakt. Kleurstoffen
helpen u
zien duidelijk het monster
dat u toevoegt aan de gelputten in de buurt van de negatieve elektrode van de elektroforese-eenheid.

A positieve elektrode bevindt zich aan het andere uiteinde. Een bekende standaard van DNA-fragmenten wordt in de eerste put geplaatst die een ladder van DNA-banden zal creëren voor vergelijking en identificatie.

De fosfaatruggengraat van DNA-moleculen geeft DNA een negatieve lading. Tegenpolen trekken elkaar aan, dus DNA-moleculen worden aangetrokken door de positieve elektrode en beginnen te bewegen of te 'migreren' wanneer een elektrische stroom wordt ingeschakeld.

DNA-fragmenten van kleinere grootte reizen sneller dan grotere fragmenten omdat ze elkaar tegenkomen minder weerstand bij het migreren door de poreuze matrix van de gel. DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte vormen banden van DNA in de gel.
Loading Dye Doel en belang

DNA is kleurloos, dus het toevoegen van tracking-kleurstoffen
aan een monster helpt u om de bewegingssnelheid van verschillende grootte eiwitmoleculen in de gel tijdens elektroforese. Voorbeelden van het laden van kleurstoffen die meebewegen met het DNA-monster zijn broomfenolblauw en xyleencyanol.

De gekozen kleurstof mag niet reactief zijn of het DNA veranderen. Bromofenolblauw is een kleurstof die wordt gebruikt om kleinere DNA-strengen te volgen die ongeveer 400 basenparen bevatten, terwijl xyleencyanol beter is voor grotere DNA-strengen met maximaal 8.000 basenparen. De gekozen kleurstof mag niet reactief zijn of het DNA veranderen.
Rol van Glycerol in Agarose Gel-elektroforese

Wanneer u uw DNA-monster klaar maakt voor elektroforese, moet u glycerol en water toevoegen samen met laadkleurstoffen. Glycerol is een zware, stroperige substantie die meer dichtheid aan het DNA-monster geeft voordat het in de putjes aan het ene uiteinde van de gelplaat wordt ingebracht.

Zonder glycerol zou het DNA-monster dispergeren in plaats van zinken en een laag in de put zoals het hoort te doen om een DNA-ladder te vormen.
Tracking Dye in SDS PAGE

Natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS PAGE) is een techniek die geschikt is voor het scheiden van eiwitten en aminozuren , die kleiner en complexer zijn dan lineaire DNA-moleculen. Polyacrylamide (SDS PAGE gel) wordt gebruikt in plaats van agarosegel voor elektroforese.

Bromophenol blue (BPB) wordt aan de monsterbuffer toegevoegd als een volgkleurstof
die in dezelfde scheidingsrichting beweegt eiwitten en begrenst hun voorsprong.
Rol van DNA-bindende kleurstof

DNA-bindende kleurstof zoals oranje gekleurde ethidiumbromide kan worden toegevoegd aan gel of aan de elektroforese buffer. Zoals de naam al doet vermoeden, hecht de kleurstof aan het DNA-molecuul.

Bij het hanteren van deze mutagene kleurstof moet grote voorzichtigheid worden betracht omdat het aan DNA in huidcellen kan binden. In tegenstelling tot volgkleurstoffen fluoresceert ethidiumbromide helder onder UV-licht, waardoor de DNA-banden zichtbaar worden.