Wetenschap
Onderzoek verbetert multiplexmutagenese om de experimentele efficiëntie bij het bewerken van plantengenoom te vergroten
CRISPR/Cas9 blijft het krachtigste hulpmiddel om mutaties in plantengenomen te genereren. Het bestuderen van de verschillende combinaties van mutaties heeft de schaal van experimentele opstellingen aanzienlijk vergroot, waardoor er meer ruimte nodig is om talloze planten te laten groeien.
Onderzoekers van het VIB-UGent Centrum voor Plantensysteembiologie hebben de multiplexmutagenese verbeterd, wat de complexiteit en de kosten van grootschalige genoombewerkingsprojecten vermindert. Hun resultaten zijn gepubliceerd in The Plant Journal .
CRISPR/Cas-experimenten worden voortdurend groter, niet alleen in termen van het aantal mutanten dat door nauwkeurige genoombewerking wordt gecreëerd, maar ook in termen van het aantal genen dat tegelijkertijd kan worden gemuteerd. Het laboratorium van Thomas Jacobs van VIB-UGent Centrum voor Plantensysteembiologie heeft schermen ontwikkeld om systematisch tientallen, honderden of zelfs duizenden genen tegelijk te muteren.
Het doel is om de efficiëntie van erfelijke kiemlijnmutaties te verbeteren en uiteindelijk de complexiteit en kosten van grootschalige genomische editingprojecten te verminderen.
Om dit te bereiken concentreerde het team zich op twee belangrijke aspecten van het CRISPR/Cas9-vectorontwerp:de promotor die Cas9-expressie aanstuurt, en de nucleaire lokalisatiesignalen (NLS) die het eiwit naar de kern leiden. Door duizenden Arabidopsis-planten te genotyperen, ontdekten ze dat het gebruik van de RPS5A-promotor om Cas9 tot expressie te brengen tot de hoogste mutatiesnelheid leidde, en dat het flankeren van het Cas9-eiwit met bipartiete NLS de meest efficiënte configuratie was om kiemlijnmutaties te creëren.
De combinatie van deze twee elementen resulteert in de hoogst waargenomen efficiëntie van multiplexbewerking, waarbij 99% van de planten ten minste één knock-outmutatie herbergt en meer dan 80% met 4 tot 7 mutaties.
"Dit vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van plantengenetica en biedt een betrouwbaar en efficiënt hulpmiddel voor onderzoekers die zich richten op complexe genetische manipulatie. Wat ik bijzonder interessant vind is het effect van de NLS. Ik durf te zeggen dat het een sterker effect had dan het bevorderen ”, zegt Dr. Thomas Jacobs, groepsleider bij VIB-UGent Centrum voor Planten Systeembiologie
De in het onderzoek bereikte optimalisaties verminderen de complexiteit en kosten van grootschalige genoombewerkingsprojecten in de plantenwetenschap aanzienlijk. Om het in cijfers uit te drukken:met hun vorige vector was voor een CRISPR-scherm dat op zoek was naar alle dubbele knock-outs van slechts 20 genen naar schatting een populatie van ongeveer 18.000 planten nodig. Met de nieuwe vectoren zouden er ongeveer 3.000 planten nodig zijn.
"Deze optimalisaties zullen nuttig zijn om knock-outs van hogere orde te genereren in de kiemlijn van Arabidopsis en zullen waarschijnlijk ook van toepassing zijn op andere CRISPR-systemen", zegt Ward Develtere, Ph.D. student en hoofdauteur van het rapport.