Voordat ze DNA kunnen sequencen of veranderen via genetische manipulatie, moeten wetenschappers het eerst isoleren. Dit lijkt misschien een moeilijke taak, omdat cellen een grote verscheidenheid aan andere verbindingen bevatten, zoals eiwitten, vetten, suikers en kleine moleculen. Gelukkig kunnen biologen de chemische eigenschappen van DNA gebruiken om DNA van deze verontreinigingen te scheiden en het voor te bereiden op verder onderzoek. Dit proces wordt DNA-extractie genoemd.

Cell Lysis-logo

Er zijn veel verschillende technieken gebruikt voor DNA-extractie. Degene die door een individueel laboratorium wordt gebruikt, is afhankelijk van het soort experiment dat moet worden uitgevoerd en hoe puur het DNA moet zijn. Wetenschappers beginnen meestal met een monster met cellen - bijvoorbeeld een weefsel of bloedmonster - en breken de cellen open, of lyseren ze. Er zijn verschillende manieren om cellen te lyseren. Het toevoegen van een afwasmiddel zal ervoor zorgen dat ze uit elkaar vallen, waardoor ze worden blootgesteld aan hoogfrequente geluidsgolven. Als alternatief kan het mengen van het monster met glasparels en snel trillen de cellen fysiek van elkaar scheiden en hun inhoud vrijgeven.

Snelle en vuile benaderingen

Als een hoge zuiverheid niet vereist is, kunnen wetenschappers een enzym genaamd proteinase K om de meeste eiwitten in het monster af te breken en vervolgens te gebruiken zoals het is. Deze techniek is echter erg vuil, omdat de meeste verontreinigingen nog steeds aanwezig zijn, dus het is alleen geschikt als snelheid een prioriteit is en zuiverheid geen probleem is. Een andere snelle en vuile benadering is om eiwitten te verwijderen door de zoutconcentratie te verhogen door zouten zoals ammonium of kaliumacetaat toe te voegen om de eiwitten te laten neerslaan. Deze techniek is ook behoorlijk vuil, omdat er nog veel andere verontreinigingen aanwezig zijn.

Fenol-chloroformextractie

Een andere aanpak is om de cellen te lyseren met wasmiddel en dan de oplossing te mengen met isoamylalcohol, chloroform en fenol . De oplossing scheidt zich vervolgens in twee lagen. Eiwitten komen terecht in de bovenste organische laag, terwijl DNA in de onderste waterlaag blijft. Deze techniek vereist een zorgvuldige controle van de zoutconcentratie en de pH voor goede resultaten. Het is tijdrovend en zowel fenol als chloroform zijn zeer giftige chemicaliën. Hoewel fenol-chloroformextracties ooit routinematig waren, zijn andere technieken de laatste jaren steeds populairder geworden.

Anion-uitwisselingschromatografie

Anionenwisselingschromatografie biedt hogere zuiverheid en consistentere resultaten dan fenol -chloroform extractie. Een buis of kolom zit vol met kleine deeltjes met positief geladen plaatsen op plaatsen waar een negatief geladen molecuul of anion kan binden. DNA bindt zich aan deze anion-uitwisselingsplaatsen terwijl andere verontreinigingen zoals eiwitten en RNA van de kolom worden afgewassen. Later wordt een zoutrijke oplossing gebruikt om het DNA uit de kolom te trekken.

Kits

De snelste en misschien wel meest betrouwbare techniek voor het zuiveren van DNA is het gebruik van een speciaal vervaardigd pakket. Deze kits bevatten silicagelmembranen in een buis. Het DNA kleeft aan het membraan terwijl andere verontreinigingen worden weggespoeld met behulp van een reeks speciaal bereide zoutoplossingen die bij de kit worden geleverd. Uiteindelijk wordt het DNA van de kolom afgewassen met een zoutarme oplossing. Deze kits zijn snel, gemakkelijk te gebruiken en bieden reproduceerbare resultaten.

Absorptie-index

Nadat het DNA is geïsoleerd en geresuspendeerd in een pH-gecontroleerde bufferoplossing, is de laatste stap het testen van de zuiverheid . Een eenvoudige en handige manier om dit te doen, is door te controleren hoeveel ultraviolet licht het absorbeert op de golflengten van 260 en 280 nanometer. De absorptie bij 260 nanometer gedeeld door absorptie bij 280 nanometer zou gelijk moeten zijn aan 1,8 als het DNA zuiver is. Door de absorptie bij 260 nanometer te meten, kun je ook de concentratie van het DNA bepalen.