De genetische blueprint van een cel wordt gecodeerd in het genetisch materiaal of het DNA. Aangezien het DNA nooit de kern van de cel verlaat, is het, om deze informatie in het cytoplasma te krijgen waar andere eiwitten en biochemische componenten verblijven, nodig om eerst het DNA in messenger-RNA (mRNA of poly (A) RNA) te transcriberen. Dit mRNA wordt dan omgezet in eiwitten die veel functies van de cel uitvoeren. Voor het detecteren of kwantificeren van zeer zeldzame mRNA's, het maken van probes voor microarrays of het construeren van bibliotheken van complementaire DNA-moleculen, moet mRNA worden geïsoleerd. Totale RNA (dat wil zeggen al het RNA in een cel) extractie en daaropvolgende mRNA-isolatie zijn echter niet elkaar uitsluitende processen; de eerstgenoemde moet worden uitgevoerd om het mRNA te kunnen extraheren.

Isolatie van het mRNA van totaal RNA

TRIzol-homogenisatie: totaal RNA omvat alle mRNA, transfer-RNA, ribosomaal RNA en andere niet-coderende RNA's . Om deze te scheiden van andere cellulaire componenten, wordt de cel eerst opengebroken om de inhoud vrij te geven. Dit wordt gedaan door cellen te resuspenderen die gepelleteerd zijn door centrifugeren (spinnen bij hoge snelheden) in TRIzol Reagent (Life Technologies). Andere versies van TRIzol (zoals Ambion's TRI-reagens) werken op dezelfde manier.

Totale RNA-isolatie: een reeks centrifugaties wordt gebruikt om de verschillende componenten (eiwitten, DNA, RNA) van de cel in lagen of fasen te scheiden , binnen de opschorting. De bovenste, geelgekleurde fase bestaat uit vet en kan worden weggegooid. De gewenste fase is rood gekleurd, bevat het totale RNA en wordt behouden. Na het uitvoeren van een fenol-chloroform-extractie en een reeks wassingen met alcohol onder toepassing van isopropanol en ethanol, kan het RNA worden gepelleteerd voor mRNA-isolatie. Voeg RNase-remmers toe om te voorkomen dat dit enzym het totale RNA afbreekt.
MRNA-extractie: het is gebruikelijk om een ​​kit te gebruiken om mRNA's te isoleren, omdat zelfgemaakte laboratoriumprotocollen geen grote hoeveelheden zeer gezuiverde mRNA's genereren. Commerciële kits omvatten Invitrogen's FastTrack 2.0 of Ambion's Poly (A) Pure mRNA-isolatiekit. Deze basisstappen zijn gebruikelijk voor dergelijke kits:

a) Meng de RNase-geremde lysisbuffer in de kit met maximaal 300 microliter totaal RNA.

b) Verwarm gedurende 5 minuten op 65 graden Celsius en vervolgens het monster onmiddellijk op ijs gedurende één minuut afkoelen.

c) Meng dit met 0,5 M natriumchloride en los Oligo dT (oligodeoxythymidylzuur) volledig op in dit monster.

d) Centrifugeer dit monster en win het supernatant dat meerdere keren is gewassen in een reeks binding- en laagzoutbuffers in de kits.

e) Verdeel mRNA meerdere keren tot een kit-gespecificeerd volume (bijv. 500) microliters) wordt verkregen.

f) Precipiteer het eluaat met natriumacetaat en ethanolprecipitatie. Opnieuw suspenderen in maximaal 20 microliter met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water.

g) Opslaan bij -80 graden Celsius en controleren op kwaliteit en kwantiteit met spectrofotometrie.

Tip

Houd alle reagentia, cellen en RNA koud door onderdompeling in ijs. Dit voorkomt dat het RNA wordt afgebroken door andere enzymen die vrijkomen tijdens het homogenisatieproces.

Waarschuwingstest

Reagentia zoals TRIzol zijn giftig en mogen niet in contact komen met de huid of slijmvliezen. Neem altijd veilige laboratoriumprotocollen in acht bij het hanteren van dit reagens.