science >> Wetenschap >  >> Biologie

De nadelen van gelelektroforese

Gelelektroforese is een techniek waarbij biologische moleculen van elkaar worden gescheiden en worden geïdentificeerd in biologisch onderzoek of medische diagnostiek. Sinds hun ontwikkeling in de jaren zeventig zijn deze technieken van onschatbare waarde bij het identificeren van genen (DNA) en genproducten (RNA en eiwitten) van wetenschappelijk belang. In de afgelopen jaren zijn nieuwere technieken naar voren gekomen die meer specificiteit en detail geven over wat er gebeurt in levende systemen. Hoewel deze technieken de elektroforese niet hebben vervangen en geavanceerde manipulaties de levensvatbaarheid van de techniek kunnen vergroten, is het belangrijk om te beseffen wat gelelektroforese wel en niet kan doen.
Electrophorresis heeft beperkte monsteranalyse

Elektroforese is specifiek voor welk weefsel je ook hebt gesampled. Als u bijvoorbeeld een Southern-vlek (een soort elektroforese) uitvoert op een wangstaafje, kijkt u naar genen uit de epitheelcellen van uw wang en nergens anders in uw lichaam. Soms kan dit gunstig zijn, maar onderzoekers zijn vaak geïnteresseerd in meer wijdverbreide effecten.

Technieken zoals in situ hybridisatie (ISH) kunnen een stukje weefsel nemen en genexpressie analyseren op elk klein gebied van dat monster . Zo kunnen onderzoekers elk ISH-gebied in een monster met ISH bekijken, terwijl elektroforese technieken slechts naar een paar gebieden tegelijk kunnen kijken.
Elektroforese metingen zijn niet nauwkeurig

Gelelektroforese kan vergelijkbare eiwitten effectief scheiden met verschillende gewichten (dit is een techniek die Western-blotting wordt genoemd). Het kan ze nauwkeuriger scheiden door een techniek die bekend staat als 2D-elektroforese; dit is gebruikelijk in proteomics.

Helaas zijn alle metingen die met deze techniek zijn gedaan op zijn best semi-kwantitatief. Om de precieze massa (gewicht) van eiwitten te verkrijgen, moet massaspectroscopie worden gebruikt nadat het eiwit is gezuiverd door elektroforese. Bovendien is het vergelijken van de relatieve hoeveelheden van verschillende moleculen afhankelijk van de banddichtheid (duisternis) van verschillende vlekken op de gel. Deze methode heeft een zekere mate van fout en monsters worden meestal meerdere keren uitgevoerd om schone resultaten te krijgen.
Aanzienlijk startmonster is vereist

Elektroforese is een techniek voor het isoleren en visueel identificeren van verschillende biomoleculen. Dit wordt gedaan door een elektrische stroom door de gel te leiden om geladen moleculen met verschillende gewichten te scheiden. Als het molecuul waarin je geïnteresseerd bent niet voldoende voorkomt, is de band vrijwel onzichtbaar en moeilijk te meten.

DNA en RNA kunnen enigszins worden versterkt voordat elektroforese wordt uitgevoerd, maar het is niet praktisch om te doen dit met eiwitten. Daarom is een groot weefselmonster nodig om deze tests uit te voeren. Dit kan het nut van de techniek beperken, vooral bij medische analyses. Het is vrijwel onmogelijk om elektroforese uit te voeren op monsters uit een enkele cel; flowcytometrie en immunohistochemie worden vaker gebruikt om cel-voor-cel-expressie van eiwitten te beoordelen. Een techniek die PCR wordt genoemd, is uitstekend in het nauwkeurig meten van kleine hoeveelheden RNA.
Alleen bepaalde moleculen kunnen worden gevisualiseerd

Elektroforese is uitstekend in het scheiden en identificeren van middelgrote tot grote biomoleculen. Veel van de moleculen waar onderzoekers naar willen kijken, zijn echter kleiner; kleine hormonen, neurotransmitters en ionen kunnen niet worden gemeten met elektroforese. Dit is om twee redenen: ze reageren niet goed met het elektroforesepreparaat (meestal een techniek die SDS-PAGINA wordt genoemd) en, zelfs als ze dat deden, zijn ze te klein om goed te scheiden en zouden ze de bodem van de gel uitlopen. Deze moleculen worden in plaats daarvan gemeten met technieken zoals RIAA's (radio-immunoassays) en ELISA's (enzym-gekoppelde immunosorbant assay).
Elektroforese is lage doorvoer

Gelelektroforese is over het algemeen lage doorvoer, wat betekent dat het geen gegevens bijzonder snel. Contrastelektroforese, waarbij u tegelijkertijd een klein handvol RNA-moleculen kunt bekijken, met PCR (polymerasekettingreactie), die tegelijkertijd duizenden monsters kan beoordelen. Evenzo kan flowcytometrie metingen uitvoeren van duizenden individuele cellen en complexe correlaties maken, terwijl elektroforese massaal naar cellen kijkt en dergelijke fijne onderscheidingen niet kan maken. PCR en flowcytometrie vertegenwoordigen respectievelijk massale parallelle en seriële processen, en beide overtreffen de mogelijkheden van elektroforese om onderzoeksgegevens te genereren veel.