Moleculair klonen is een gebruikelijke biotechnologische methode die elke student en onderzoeker moet kennen. Moleculaire klonering met behulp van een type enzym, een restrictie-enzym genaamd, om menselijk DNA in fragmenten te knippen die vervolgens in het plasmide-DNA van een bacteriële cel kunnen worden ingebracht. Restrictie-enzymen snijden dubbelstrengig DNA doormidden. Afhankelijk van het restrictie-enzym kan de snede resulteren in een kleverig uiteinde of een stomp uiteinde. Kleverige uiteinden zijn meer bruikbaar bij moleculaire klonering omdat ze ervoor zorgen dat het menselijke DNA-fragment in de juiste richting in het plasmide wordt ingebracht. Het ligatieproces of het fuseren van DNA-fragmenten vereist minder DNA wanneer het DNA kleverige uiteinden heeft. Ten slotte kunnen meerdere klevende eindrestrictie-enzymen hetzelfde kleverige uiteinde produceren, hoewel elk enzym een ​​andere restrictiesequentie herkent. Dit verhoogt de kans dat uw DNA-regio van belang kan worden verwijderd door plakkerige enzymen.

Beperkingen Enzymen en restrictieplaatsen

Restrictie-enzymen zijn enzymen die knippen herkennen specifieke sequenties op dubbelstrengs DNA en snijd het DNA in die volgorde in tweeën. De herkende reeks wordt de restrictieplaats genoemd. Restrictie-enzymen worden endonucleasen genoemd omdat ze dubbelstrengig DNA knippen, dat is hoe DNA normaal bestaat, op locaties die zich tussen de uiteinden van het DNA bevinden. Er zijn meer dan 90 verschillende restrictie-enzymen. Elk herkent een afzonderlijke restrictiesite. Restrictie-enzymen splitsen hun respectieve restrictieplaatsen 5.000 keer efficiënter op dan andere sites die ze niet herkennen.

De juiste richting

Restrictie-enzymen zijn er in twee algemene klassen. Ze knippen DNA in plakkerige uiteinden of botte uiteinden. Een kleverig uiteinde heeft een kort gebied van nucleotiden, de bouwstenen van DNA, dat ongepaard is. Deze ongepaarde regio wordt een overhang genoemd. De overhang wordt kleverig genoemd omdat hij wil en zal paren met een ander kleverig uiteinde dat een complementaire overhangsequentie heeft. Kleverige uiteinden zijn als een lang verloren tweeling die elkaar stevig probeert te omhelzen als ze elkaar ontmoeten. Aan de andere kant zijn stompe uiteinden niet plakkerig omdat alle nucleotiden al zijn gepaart tussen de twee strengen DNA. Het voordeel van plakkerige uiteinden is dat een fragment van menselijk DNA alleen in één richting in een bacterieel plasmide kan passen. Als daarentegen zowel het menselijke DNA als het bacteriële plasmide botte uiteinden hebben, kan het menselijke DNA van kop tot staart of van staart tot staart in het plasmide worden ingebracht.

Liggende kleverige uiteinden vereist minder DNA

Hoewel DNA met stokuiteinden gemakkelijker is om elkaar te vinden vanwege hun "kleverigheid", kunnen plakkerige uiteinden en stompe uiteinden niet samensmelten tot een doorlopend stuk DNA. De vorming van een continu stuk DNA dat volledig gekoppeld is, vereist een enzym dat een ligase wordt genoemd. Ligasen verbinden de ruggengraten van nucleotiden aan de kleverige of stompe uiteinden, resulterend in een continue keten van nucleotiden. Omdat kleverige uiteinden elkaar sneller vinden vanwege hun aantrekkingskracht voor elkaar, vereist het ligatieproces minder menselijk DNA en minder plasmide-DNA. De stompe uiteinden van DNA en plasmiden hebben minder kans om elkaar te vinden, en dus vereist ligatie van stompe uiteinden dat er meer DNA in de reageerbuis wordt geplaatst.

Verschillende enzymen kunnen hetzelfde kleverige uiteinde gebruiken

Restrictieplaatsen zijn verspreid over het hele genoom van organismen, maar zijn niet gelijkmatig verdeeld. In plasmiden kunnen ze zo worden ontworpen dat ze zich vlak naast elkaar bevinden. Wetenschappers die een fragment van het menselijk DNA uit het menselijk genoom willen verwijderen, moeten restrictieplaatsen vinden die zich vooraan en achteraan in het fragment van het fragment bevinden. Naast het verzekeren dat een DNA-fragment in de juiste richting wordt ingevoegd, kunnen verschillende kleverige uiteinde-enzymen hetzelfde kleverige uiteinde creëren, hoewel ze verschillende restrictiesequenties herkennen. BamHI, BglII en Sau3A hebben bijvoorbeeld verschillende herkenningssequenties maar produceren hetzelfde GATC-kleefuiteinde. Dit vergroot de kans dat er sites voor vastgeplakte restricties zijn die uw menselijke gen van belang flankeren.