Een vijver in de zomer kan meer vertellen over een vis dan een vijver in de winter. De vissen die in ijzige omstandigheden leven, kunnen stil genoeg blijven om zijn schubben te bestuderen, maar om te begrijpen hoe de vis zwemt en zich gedraagt, het moet vrij kunnen bewegen in drie dimensies. Hetzelfde geldt voor het analyseren hoe biologische items, zoals virussen, bewegen in het menselijk lichaam, volgens een onderzoeksteam onder leiding van Deb Kelly, Huck Chair in Molecular Biophysics en hoogleraar biomedische technologie aan Penn State, die geavanceerde elektronenmicroscopie (EM) technologie heeft gebruikt om te zien hoe menselijke virussen in hoge resolutie bewegen in een bijna natuurlijke omgeving. De visualisatietechniek zou kunnen leiden tot een beter begrip van hoe vaccinkandidaten en behandelingen zich gedragen en functioneren als ze interageren met doelcellen, zei Kelly.

In een poging om de tools uit te breiden die wetenschappers hebben om de microscopische wereld te bestuderen, onderzoekers hebben live opgenomen, 20 seconden durende films van menselijke virussen die in bijna atomaire details in vloeistof drijven in een elektronenmicroscoop. Dezelfde mate van informatie, onmiddellijk beschikbaar als ze opnemen, kan tot 24 uur duren om te verwerven met behulp van traditionele statische beeldvormingsmethoden. Hun aanpak en resultaten zijn online beschikbaar gesteld op 24 juli in Geavanceerde materialen .

"De uitdaging bleef om biologische materialen te zien in dynamische systemen die hun authentieke prestaties in het lichaam weerspiegelen, " zei Kelly, die ook het Penn State Center for Structural Oncology leidt. "Onze resultaten laten nieuwe structuren en actieve inzichten zien van menselijke virussen in kleine hoeveelheden vloeistof - even groot als ademhalingsdruppeltjes die SARS-CoV-2 verspreiden."

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) wordt de gouden standaard van het veld voor het observeren van monsters met of boven atomaire resolutie, volgens Kelly. De techniek omvat het flitsbevriezen van het monster en het focussen van een bundel elektronen er doorheen. De elektronen en de componenten van het monster interageren, die wordt opgevangen door detectoren die in het instrument zijn ingebed. Duizenden afbeeldingen kunnen worden verwerkt om te berekenen hoe het item eruitziet in 3D, maar er is meer nodig om volledig te begrijpen hoe het item functioneert in een meer natuurlijke omgeving.

"Hoewel cryo-EM ons veel informatie kan vertellen, het produceert nog steeds een statisch beeld, " zei GM Jonaid, de eerste auteur van het artikel en een student in het Bioinformatics and Genomics Graduate Program in de Huck Institutes of the Life Sciences. Jonaid voert zijn promotieonderzoek uit in het laboratorium van Kelly. "Met verbeterde chips en een krachtige directe detector op de microscoop, we kunnen veel filmframes verzamelen om te zien hoe het monster in realtime werkt. We kunnen de dingen zien zoals ze bestaan, niet alleen hoe we ze hebben voorbereid."

De onderzoekers gebruikten adeno-associated virus (AAV) als modelsysteem om hun aanpak te demonstreren. AAV is een biologisch nanodeeltje dat kan worden gebruikt om vaccins of behandelingen rechtstreeks aan cellen te leveren. Het platform is gebaseerd op een gekaapt adenovirus, die gemakkelijk verschillende soorten cellen kan binnendringen. Het gemak waarmee het in wisselwerking staat met cellen, maakt het een nuttige capsule om zijn ontworpen lading te vervoeren.

"AAV is een bekende, gentherapie-vehikel met huidige toepassingen die betrokken zijn bij medicijnafgifte en vaccinontwikkeling voor COVID-19, Kelly zei. "Dit modelsysteem is al goed bestudeerd, dus we kunnen het gebruiken om onze aanpak te valideren met als doel biologische rechten in vloeibare toestand te zien, zoals die in het menselijk lichaam wordt gehandhaafd."

De onderzoekers pasten minieme volumes vloeibare oplossing met AAV toe aan de putjes van gespecialiseerde siliciumnitride-microchips, commercieel geleverd door Protochips Inc. Vervolgens plaatsten ze de microchip-assemblages in de EM om de virussen in actie te onderzoeken.

"De beelden zijn zeer vergelijkbaar met cryo-EM-gegevens, maar de voorbereiding was minder ingewikkeld, minder technisch betrokken, ' zei Jonaid. 'Toen we de beelden hadden, snel genomen, als frames van een film, we verwerkten ze net zoals we andere gegevens met een hoge resolutie zouden verwerken."

De resultaten waren video's van AAV die in vloeistof bewoog, met subtiele veranderingen in het oppervlak van het deeltje, wat suggereert dat de fysieke eigenschappen van het deeltje veranderen als het zijn omgeving verkent, zei Kelly. De resolutie was dichtbij drie tot vier Angstrom (een enkel atoom wordt gemeten als één Angstrom).

Toen ze eenmaal bewezen hadden dat de beeldvormingsstrategieën werkten, de onderzoekers richtten hun pijlen op een kleiner doelwit:antilichamen geproduceerd door COVID-19-patiënten.

"We zagen hoe antilichamen in het serum van COVID-19-patiënten een interactie aangingen met de resterende SARS-CoV-2-deeltjes, "Kel zei, opmerkend dat het vermogen om dergelijke interacties te observeren vooral nuttig zou zijn bij het beoordelen van de levensvatbaarheid van vaccinkandidaten voorafgaand aan klinische proeven.

Kelly en haar team zijn van plan door te gaan met het onderzoeken van de moleculaire onderbouwing van SARS-CoV-2 en gastheerreceptor-eiwitten met behulp van vloeibare fase-EM, als aanvulling op de informatie die is verkregen uit cryo-EM-resultaten.

"Je hebt echt gegevens van beide technieken nodig om te begrijpen hoe virussen eruitzien en zich gedragen in het levende lichaam, Kelly zei. "Het visualiseren van de dynamische beweging in een oplossing vormt een aanvulling op snapshots met een hoge resolutie om meer volledige informatie te onthullen."