Cellijnen die zijn geïnjecteerd met vrij nucleïnezuur worden veel gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen en het modelleren van ziekten. Om genetisch gemengde celpopulaties te vermijden, onderzoekers gebruiken verdunningstechnieken om afzonderlijke cellen te selecteren die vervolgens identieke lijnen zullen genereren. Echter, de route van het beperken van verdunningen is vervelend en tijdrovend.

Een nieuwe studie door Noordwest-onderzoekers laat zien hoe Nanofountain Probe Electroporation (NFP-E), een hulpmiddel dat moleculen aflevert in eencellige, zou dat probleem kunnen oplossen, en zou kunnen leiden tot nieuwe toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen en het ontwerpen van patiëntspecifieke behandelingen.

Het team, onder leiding van Horacio Espinosa van Northwestern Engineering en met inbegrip van Joshua Leonard, demonstreert de veelzijdigheid van NFP-E, dat met behulp van elektriciteit DNA of RNA in cellen introduceert. Het kan ook zowel eiwitten als plasmiden afleveren in een verscheidenheid aan dierlijke en menselijke celtypen met doseringscontrole. Het team bestond uit John Kessler, de Ken en Ruth Davee hoogleraar stamcelbiologie en hoogleraar neurologie en farmacologie aan de Northwestern University Feinberg School of Medicine.

De nieuwe methode kan worden gebruikt om ziekten te bestuderen of voor celtherapie. In de vorige, het genoom wordt gemanipuleerd. In het laatstgenoemde, genbewerking vindt plaats in cellen zoals T-cellen om kanker te behandelen met immuuntherapieën.

Door eencellige elektroporatie toe te passen, het proces van het introduceren van DNA of RNA in afzonderlijke cellen met behulp van een elektrische puls, die kortstondig poriën in het celmembraan openen, hun werk laat zien hoe NFP-E fijne controle bereikt over de relatieve expressie van twee gecotransfecteerde plasmiden. Bovendien, door eencellige elektroporatie te combineren met time-lapse fluorescerende beeldvorming, hun onderzoek onthult karakteristieke tijden voor het sluiten van elektroporiën.

"We hebben het potentieel van de NFP-E-technologie aangetoond bij het manipuleren van een verscheidenheid aan celtypen met stoichiometrische controle van moleculaire lading die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van een breed scala aan onderzoeken bij het screenen van geneesmiddelen, celtherapieën, en synthetische biologie, " zei Espinosa, James N. en Nancy J. Farley Professor in productie en ondernemerschap en professor in werktuigbouwkunde en (met dank aan) biomedische technologie en civiele en milieutechniek.

Momenteel, biomoleculen kunnen op verschillende manieren in cellen worden afgeleverd:virale vectoren; chemische dragers, zoals celpenetrerende peptiden en polymere nanocapsules; lipofectamine, en bulkelektroporatie.

"Er bestaan ​​een aantal strategieën voor het afleveren van biomoleculen in cellen, maar elk heeft zijn beperkingen, " zei Leonard, universitair hoofddocent chemische en biologische technologie en Charles Deering McCormick Professor of Teaching Excellence. "Bijvoorbeeld, chemische dragers zorgen voor een relatief langzame afgifte en kunnen giftig zijn voor de cel; virale vectoren zijn vaak efficiënt, maar kunnen nadelige immuunresponsen en insertiegenotoxiciteit induceren. Het gebruik van een traditionele methode vereist vaak aanzienlijke inspanningen om het protocol te optimaliseren, afhankelijk van het celtype en de te leveren molecule, en, daarom, een gemakkelijk generaliseerbare strategie voor het afleveren van biomoleculen zou een aantal zinvolle voordelen bieden."

Het nieuwe NFP-E-systeem maakt eencellige levering van DNA mogelijk, RNA, en eiwitten in verschillende onsterfelijk gemaakte cellijnen en primaire cellen met meer dan 95 procent efficiëntie en meer dan 90 procent levensvatbaarheid van de cellen.

"De resultaten geven aan dat de hersluittijd van het celmembraan niet-lineair is met de pulsspanning en het aantal elektroporatiepulsen, het bereiken van een maximum bij tussenliggende waarden, Espinosa zei. "Dat betekent dat lange pulserende tijden of hoge spanningen niet nodig lijken te zijn voor efficiënt moleculair transport over celmembranen. Die functie is belangrijk voor het verkrijgen van een hoge transportefficiëntie terwijl de celtoxiciteit tot een minimum wordt beperkt."

Met behulp van eencellige elektroporatietechnologie, de onderzoekers waren in staat om transportmechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij gelokaliseerde op elektroporatie gebaseerde celbemonstering. Een obstakel voor niet-destructieve tijdelijke eencellige bemonstering zijn de kleine hoeveelheden cytosol - de vloeistof in cellen - die worden geëxtraheerd, wat het een uitdaging maakt om RNA-sequenties of eiwitten te testen of te detecteren.

Onderzoek toonde aan dat de schaling van de hersluittijd van het membraan een functie is van verschillende elektroporatieparameters, het verschaffen van inzicht in post-pulse elektroporiëndynamica.

"Het werk richt zich op de noodzaak om manieren te begrijpen om de hoeveelheid cytosolmonsters te verhogen, zonder de cellen nadelig te beïnvloeden, "Zei Espinosa. "Dat kan de onderzoeksgemeenschap leiden bij het ontwerpen van experimenten die gericht zijn op op elektroporatie gebaseerde bemonstering van intracellulaire moleculen voor temporele celanalyse."

Dit onderzoek is gerelateerd aan eerder werk dat een minimaal invasieve methode heeft ontwikkeld om cellen te bemonsteren die meerdere keren kunnen worden herhaald. Dat eerdere onderzoek, die elektrische pulsen gebruikte om enzymen uit het cytosol te extraheren, geholpen begrip van de kinetiek van porievorming en sluiting.

De krant, "Nanofountain Probe Electroporation maakt veelzijdige eencellige intracellulaire levering en onderzoek van postpulse Electropore Dynamics mogelijk" werd op 2 oktober gepubliceerd in het tijdschrift Klein .