Onderzoekers van de Columbia University, met collega's bij Genia Technologies (Roche), Harvard University en het National Institute of Standards and Technology (NIST) rapporteren het bereiken van real-time elektronische DNA-sequencing van één molecuul met een resolutie van één base met behulp van een eiwit-nanopore-array.

DNA-sequencing is de sleuteltechnologie voor gepersonaliseerde en precisiegeneeskunde-initiatieven, snelle ontdekkingen in de biomedische wetenschap mogelijk maken. De volledige genoomsequentie van een individu biedt belangrijke markers en richtlijnen voor medische diagnostiek, gezondheidszorg, en het behouden van een gezond leven. Daten, de kosten en snelheid die gemoeid zijn met het verkrijgen van zeer nauwkeurige DNA-sequenties waren een grote uitdaging. Hoewel er de afgelopen tien jaar verschillende vorderingen zijn gemaakt, de high-throughput sequencing-instrumenten die tegenwoordig veel worden gebruikt, zijn afhankelijk van optica voor de detectie van vier DNA-bouwstenen:A, C, G en T. Om alternatieve meetmogelijkheden te verkennen, elektronische sequencing van een ensemble van DNA-templates is ontwikkeld voor genetische analyse. Nanopore strengsequencing, waarbij een enkelstrengs DNA door de poriën op nanoschaal wordt geregen onder een aangelegde elektrische spanning om elektronische signalen te produceren voor sequentiebepaling op enkelvoudig molecuulniveau, is recent ontwikkeld; echter, omdat de vier nucleotiden erg op elkaar lijken in hun chemische structuren, ze kunnen niet gemakkelijk worden onderscheiden met behulp van deze methode. Onderzoekers streven daarom actief naar onderzoek en ontwikkeling van een nauwkeurig elektronisch DNA-sequencingplatform met één molecuul, omdat het de potentie heeft om een ​​geminiaturiseerde DNA-sequencer te produceren die het genoom kan ontcijferen om gepersonaliseerde precisiegeneeskunde mogelijk te maken.

Een team van onderzoekers van Columbia Engineering, onder leiding van Jingyue Ju (Samuel Ruben-Peter G. Viele Professor of Engineering, Hoogleraar Chemische Technologie en Farmacologie, directeur van het Centrum voor Genoomtechnologie &Biomoleculaire Engineering), met collega's van de Harvard Medical School, geleid door George Church (hoogleraar genetica); Genia-technologieën, onder leiding van Stefan Roever (CEO van Genia); en John Kasianowicz, de hoofdonderzoeker bij NIST, hebben een compleet systeem ontwikkeld om DNA in nanoporiën elektronisch te sequencen op enkel molecuulniveau met een resolutie van één base. Dit werk, recht hebben, "Real-time elektronische DNA-sequentiebepaling van één molecuul door synthese met behulp van polymeergelabelde nucleotiden op een nanopore-array, " wordt gepubliceerd in het tijdschrift, Proceedings van de National Academy of Sciences ( PNAS ) Vroege editie.

Eerder, onderzoekers van de laboratoria van Ju in Columbia en Kasianowicz van NIST rapporteerden het algemene principe van nanopore-sequencing door synthese (SBS), de haalbaarheid van het ontwerp en de synthese van met polymeren gemerkte nucleotiden als substraten voor DNA-polymerase, de detectie en de differentiatie van de polymeertags door nanoporie op het niveau van een enkel molecuul [ Wetenschappelijke rapporten 2, 684 (2012) DOI:10.1038/srep00684]. De stroom PNAS paper beschrijft de constructie van het complete nanopore SBS-systeem om elektronische sequentiegegevens van één molecuul te produceren met een resolutie van één base. Deze SBS-strategie onderscheidt nauwkeurig vier DNA-basen door vier verschillende polymeertags die aan het 5'-fosfaat van de nucleotiden zijn bevestigd elektronisch te detecteren en te differentiëren tijdens hun opname in een groeiende DNA-streng die wordt gekatalyseerd door polymerase, een DNA-synthetiserend enzym. De onderzoekers ontwierpen en synthetiseerden nieuwe nucleotiden die aan het terminale fosfaat zijn getagd met op oligonucleotide gebaseerde polymeren om nanopore SBS uit te voeren op een α-hemolysine-eiwit nanopore array-platform. De tags op de met polymeer gelabelde nucleotiden, waarvan is vastgesteld dat het actieve substraten zijn voor DNA-polymerase, produceren verschillende elektrische stroom blokkade niveaus. Ze construeerden een nanoporiën-array op een elektronische chip met meerdere elektroden; de array is samengesteld uit eiwitkanalen die waren gekoppeld aan een DNA-polymerase dat was gebonden aan een geprimede DNA-matrijs. Toevoeging van verschillende op maat ontworpen nucleotiden met polymeerlabels aan de nanopore-array triggert DNA-synthese. Door de ionenstroom van het kanaal op verschillende niveaus te blokkeren, de verschillende tags bieden een realtime uitlezing van de sjabloonsequentie met een resolutie van één base.

Als Carl Fuller, hoofdauteur, Adjunct Senior Research Scientist in het Ju Laboratory van de Chemical Engineering Department in Columbia en Director of Chemistry bij Genia, wijst erop, "De nieuwigheid van onze nanopore SBS-aanpak begint met het ontwerp, synthese, en selectie van vier verschillende met polymeer gemerkte nucleotiden. We gebruiken een DNA-polymerase dat covalent is bevestigd aan de nanoporie en de gelabelde nucleotiden om SBS uit te voeren. Tijdens replicatie van het DNA gebonden aan het polymerase, de tag van elk complementair nucleotide wordt gevangen in de porie om een ​​uniek elektrisch signaal te produceren. Vier verschillende polymeertags die verschillende handtekeningen opleveren die worden herkend door de elektronische detector in de nanopore-arraychip, worden gebruikt voor sequentiebepaling. Dus, DNA-sequenties worden voor veel afzonderlijke moleculen parallel en in realtime verkregen. De vier polymeertags zijn ontworpen om onderling veel beter onderscheid te maken, in tegenstelling tot de kleine verschillen tussen de vier natieve DNA-nucleotiden, waardoor de grote uitdaging waarmee andere directe nanopore-sequencing-methoden worden geconfronteerd, wordt overwonnen." Bovendien, de tags kunnen nog verder geoptimaliseerd worden qua grootte, opladen, en structuur om optimale resolutie in het nanopore SBS-systeem te bieden.

"Dit opwindende project brengt wetenschappers en ingenieurs uit zowel de academische wereld als de industrie samen met gecombineerde expertise in moleculaire engineering, nanotechnologie, genomica, elektronica en datawetenschap om revolutionaire, kosteneffectieve genetische diagnostische platforms met ongekend potentieel voor precisiegeneeskunde, " zegt Ju. "We zijn buitengewoon dankbaar voor de genereuze steun van de NIH die ons in staat heeft gesteld snelle vooruitgang te boeken in het onderzoek en de ontwikkeling van de nanopore SBS-technologie, en de uitstekende bijdragen van alle leden van ons onderzoeksconsortium."

Volgens Ju, de onderzoekers hebben al verder geduwd dan wat werd aangetoond in de PNAS studie waarbij de sequentiegegevens werden verkregen op een vroege prototype-sequencer op basis van nanopore SBS. De doorvoer en prestaties van de huidige sequencer zijn verder gevorderd dan wat werd gerapporteerd in de PNAS papier. De haalbaarheid van het bereiken van leeslengtes van meer dan 1000 basen van DNA is onlangs bereikt. Vooruit gaan, het collaboratieve onderzoeksteam zal doorgaan met het optimaliseren van de tags door de linkers aan te passen, structuur, en lading op moleculair niveau, en fijnafstemming van het polymerase en de elektronica voor het nanopore SBS-systeem met als doel om een ​​volledig menselijk genoom snel en tegen lage kosten nauwkeurig te sequencen, waardoor het kan worden gebruikt in routinematige medische diagnoses.