Onderzoekers hebben een nieuwe manier ontwikkeld om atoomkrachtmicroscopie te gebruiken om snel de mechanische eigenschappen van cellen op nanometerschaal te meten. een vooruitgang die de weg zou kunnen effenen voor een beter begrip van immuunstoornissen en kanker.

In zijn rol als kinderarts Manish Butte, MD, doctoraat, zal vaak de buik van een patiënt duwen en porren, gevoel voor afwijkingen - een gezwollen milt, een verharde lymfeklier of een ongewone knobbel in de darmen of lever. Er zijn nog steeds dingen die alleen door aanraking kunnen worden verzameld, en Butte gelooft dat dit idee ook van toepassing is op individuele cellen.

Toch was het vermogen van onderzoekers om de kenmerken van levende cellen te onderzoeken en te meten bijna onbestaande. Onlangs, een team van wetenschappers en ingenieurs van Stanford trachtte die onbalans recht te zetten met een nieuwe techniek om cellen snel in kaart te brengen. Ze slaagden erin een grote vooruitgang te boeken in een technologie die bekend staat als atoomkrachtmicroscopie, of AFM, die zelf werd uitgevonden in Stanford in 1986.

Een paper waarin het werk wordt beschreven, werd online gepubliceerd op 11 november in ACS Nano . Butte, een assistent-professor kinderimmunologie, is de senior auteur. Hoofdauteurschap wordt gedeeld door Andrew Wang, doctoraat, een voormalig postdoctoraal wetenschapper in Butte's lab, en Karthik Vijayrhagavan, doctoraat, die een afgestudeerde student was en lid was van het microfotonica-lab onder leiding van Olav Solgaard, doctoraat, hoogleraar elektrotechniek.

"Hoe een cel aanvoelt - de mechanische eigenschappen die van invloed zijn op hoe het contact maakt met andere cellen en weefsels - is veel belangrijker dan hoe het eruit ziet, maar de technologie was er gewoon niet om ons in staat te stellen het te onderzoeken, Butte zei. "Er valt veel te leren van het bestuderen van de mechanica van een cel en zijn structuren net onder het oppervlak."

De manier waarop Butte en zijn collega's AFM gebruiken om de mechanische eigenschappen van cellen te meten, is vergelijkbaar met de manier waarop een bouwer met haar knokkels langs een gipsplaat tikt, luisterend naar de verandering in toonhoogte die haar zal vertellen dat er een houten nok aan de andere kant is. Wanneer een AFM-sonde op het oppervlak van een cel tikt, het trilt, en het patroon van deze trillingen, zoals de geluidsgolven die weerkaatsen door de stoeterij, geeft mechanische informatie over de structuren van de cel die wordt aangeraakt.

Echter, bestaande AFM-sondes zijn relatief groot en, als resultaat, ongevoelig voor hoge frequenties, die veel van de belangrijkste informatie over de ingewanden van een cel communiceren. Het apparaat van het Stanford-team koppelt een zeer kleine sonde aan een traditionele. Door dit samenstel kan het apparaat snellere oscillaties detecteren dan conventionele apparaten en, overeenkomstig, om meer gedetailleerde en veel snellere metingen te doen.

"Het belangrijkste verschil tussen deze en eerdere atoomkrachtmicroscopen is dat we de impact van de sonde op de cel zeer snel kunnen meten en specifieke metingen kunnen krijgen, terwijl typische AFM's gewoon een gemiddelde geven. Hierdoor kunnen we voor het eerst heel zachte materialen nauwkeurig meten, " zei Solgaard, die ook een co-auteur van het papier is.

Huidige sondes meten cellulaire stijfheid door ongeveer een of twee keer per seconde tegen de cel te tikken - de snelste die de grote sondes kunnen doen. De kleine sonde, echter, kan gemakkelijk gedetailleerde metingen uitvoeren op vijf tot tien, 000 tikken per seconde vanwege de gevoeligheid. Hij vergeleek de sprong in gevoeligheid met het verschil tussen het rijden met een Cadillac Escalade over de weg en het duwen van een Hot Wheel-speelgoedauto over hetzelfde oppervlak:"De kleine Hot Wheel zal elke kleine hobbel zoveel meer voelen dan de grote Cadillac."

'Mooie oplossing'

AFM's meten de beweging van de sonde door een laser tegen de punt te laten stuiteren. Terwijl de punt op en neer beweegt, de laser wordt gereflecteerd. De uitvinding van Stanford koppelt de kleine sonde aan de grote door middel van een vorkvormige structuur die een interferometrisch rooster wordt genoemd. Het rooster produceert een diffractiepatroon op basis van de bewegingen van de kleine sonde, en stelt de AFM in staat om zijn metingen gemakkelijk vast te leggen.

"Onze tip produceert eigenlijk een tweede signaal, en dat is wat ons in staat stelt om veel meer details te krijgen. Vanuit een technisch oogpunt, het is een uiterst eenvoudige, mooie oplossing, "Solgaard zei, verwijzend naar de afgebogen signalen van het rooster.

Beste van alles, het apparaat van het team kan direct worden aangesloten op bestaande AFM's, mogelijk miljoenen dollars besparen op nieuwe apparatuur die anders aan onderzoek zou kunnen worden besteed. Een nieuwe AFM kan oplopen tot $500, 000, volgens Solgaard.

Het doel is het cellulaire equivalent van Butte die op de buik van een kind drukt.

"We willen celstijfheid bestuderen om te begrijpen wat zich onder het oppervlak bevindt en hoe cellen zijn gestructureerd, ' zei Wang.

Als demonstratie, het team heeft een deel van een rode bloedcel gemeten, het maken van in totaal ongeveer 4 miljoen metingen in ongeveer 10 minuten - en dat allemaal zonder de delicate cellulaire buitenkant te beschadigen.

"Dezelfde metingen zouden meer dan een maand hebben geduurd om te voltooien met conventionele atoomkrachtmicroscopen, " zei Vijayraghavan. De technologie is zo snel dat het team een ​​reeks time-lapse-beelden van een levende cel kon maken, elk slechts zeven minuten uit elkaar genomen, een voorheen onvoorstelbaar tempo.

Potentiële toepassingen

De praktische toepassingen van het apparaat variëren van wetenschappelijke basiskennis van de celstructuur tot immunologie en oncologie. Wetenschappelijk begrip van de mechanische krachten die in cellen spelen is zo gebrekkig dat het veld - dat nu mechanobiologie wordt genoemd - echt in de kinderschoenen staat, volgens Butte.

De mechanische krachten in het lichaam kunnen afkomstig zijn van weefsels, die in stijfheid variëren van de zachtste hersenstof tot de stijfste botten, van de zwaartekracht, en zelfs van de duwende en trekkende bewegingen van andere cellen. Kankercellen maken hun omgeving mechanisch stijf door chemicaliën af te scheiden die de extracellulaire matrix verstevigen. Kankercellen interpreteren op dezelfde manier de mechanische krachten van een weefsel om beslissingen te nemen over groei en metastase. Verrassende feedbackloops zoals deze blijken ook voor te komen bij stamcellen in het beenmerg en tijdens de embryonale ontwikkeling. Hoe immuuncellen mechanische krachten interpreteren is nog totaal onbekend.

"Het laagst hangende fruit is kanker. Kankers zijn vaak stijver dan normaal, gezonde weefsels en die kennis kunnen we gebruiken om ziekten te diagnosticeren. Maar eerst, je moet goede gegevens hebben, die ons apparaat biedt, " zei Wang. Hij heeft al een vroege vorm van de nieuwe Stanford-sonde gebruikt in proefwerk aan borstkankerspecimens die uit borstamputaties zijn genomen.

Voor zijn deel, Butte is van plan om snelle AFM te gebruiken om het immuunsysteem te bestuderen. Hij hoopt te onderzoeken waarom anders ziektebestrijdende T-cellen vaak in een tumor slapend blijven. Hij theoretiseert dat de mechanische stijfheid van het tumorweefsel kan voorkomen dat T-cellen vrijelijk contact maken met kankercellen en hun kankerbestrijdende functies activeren. In essentie, de tumor kan te druk zijn om de T-cellen te laten werken. Aan de andere kant van het stijfheidsgamma, hij gelooft dat de zachte mechanische eigenschappen van chronisch ontstoken of geïnfecteerde weefsels het immuunsysteem tot overactiviteit aanzetten, zoals auto-immuniteit.

Het is een theorie die nog niemand heeft onderzocht vanwege technische barrières, die de snelle AFM kon overwinnen. Butte's lab is begonnen met een brede inspanning om mechanische krachten te koppelen aan immuunreacties op de moleculaire, cel- en weefselschalen. "Er is zoveel dat we niet weten over de mechanische eigenschappen van verschillende celtypes en zieke weefsels. Bijna niets, in feite, ' zei Butte. 'De eerste stap is onderzoeken. Nutsvoorzieningen, We kunnen dat doen."