Nanoporiën kunnen ooit een revolutie teweegbrengen in DNA-sequencing. Door DNA-moleculen één voor één door kleine gaatjes in een dun membraan te schuiven, het kan mogelijk zijn om razendsnel lange stukken DNA te decoderen. wetenschappers, echter, hebben nog niet helemaal de fysica ontdekt van hoe polymeerstrengen zoals DNA interageren met nanoporiën. Nutsvoorzieningen, met behulp van een bepaald type virus, onderzoekers van Brown University hebben nieuw licht geworpen op deze fysica op nanoschaal.

"Wat ons hierin interesseerde, was dat iedereen in het veld DNA bestudeerde en modellen ontwikkelde voor hoe ze interageren met nanoporiën, " zei Dirk Stein, universitair hoofddocent natuurkunde en techniek bij Brown, die het onderzoek leidde. "Maar zelfs de meest basale dingen waarvan je zou hopen dat modellen zouden voorspellen uitgaande van de basiseigenschappen van DNA - je zou het niet kunnen doen. De enige manier om uit die sleur te komen, was door iets anders te bestuderen."

De bevindingen, vandaag gepubliceerd in Natuurcommunicatie , kan niet alleen helpen bij de ontwikkeling van nanoporiën-apparaten voor DNA-sequencing, ze kunnen ook leiden tot een nieuwe manier om gevaarlijke ziekteverwekkers op te sporen.

De natuurkunde rechtzetten

Het concept achter nanopore-sequencing is vrij eenvoudig. Een gat van slechts enkele miljardsten van een meter breed wordt geprikt in een membraan dat twee plassen zout water van elkaar scheidt. Een elektrische stroom wordt toegepast op het systeem, die af en toe een geladen DNA-streng strikt en door de porie zweept - een fenomeen dat translocatie wordt genoemd. Wanneer een molecuul zich verplaatst, het veroorzaakt waarneembare variaties in de elektrische stroom door de porie. Door goed te kijken naar die variaties in stroom, wetenschappers kunnen misschien individuele nucleotiden onderscheiden - de A's, C's, G's en T's gecodeerd in DNA-moleculen.

De eerste commercieel verkrijgbare nanopore-sequencers zijn misschien nog maar een paar jaar verwijderd, maar ondanks de vooruitgang in het veld, Er is verrassend weinig bekend over de fundamentele fysica die betrokken is bij de interactie van polymeren met nanoporiën. Dat komt deels door de complexiteit van het bestuderen van DNA. in oplossing, DNA-moleculen vormen ballen van willekeurige kronkels, die het begrijpen van hun fysieke gedrag extreem moeilijk maken.

Bijvoorbeeld, de factoren die de snelheid van DNA-translocatie bepalen, worden niet goed begrepen. Soms ritsen moleculen snel door een porie; andere keren glijden ze langzamer, en niemand begrijpt helemaal waarom.

Een mogelijke verklaring is dat de kronkelende configuratie van DNA ervoor zorgt dat elk molecuul verschillen in weerstand ervaart wanneer ze door het water naar de porie worden getrokken. "Als een molecuul naast de porie verfrommeld is, het heeft een kortere reisafstand en ervaart minder weerstand, " zei Angus McMullen, een afgestudeerde natuurkundestudent bij Brown en de hoofdauteur van de studie. "Maar als het uitgerekt is, zou het over de hele lengte slepen en daardoor langzamer gaan."

Het sleepeffect is niet experimenteel te isoleren met behulp van DNA, maar het virus dat McMullen en zijn collega's bestudeerden, bood een oplossing.

De onderzoekers keken naar fd, een onschadelijk virus dat e. coli-bacteriën. Twee dingen maken het virus een ideale kandidaat voor onderzoek met nanoporiën. Eerst, fd-virussen zijn allemaal identieke klonen van elkaar. Tweede, in tegenstelling tot kronkelend DNA, fd-virus is een stijve, staafvormig molecuul. Omdat het virus niet opkrult zoals DNA dat doet, het effect van slepen op elk zou in wezen elke keer hetzelfde moeten zijn.

Met slepen geëlimineerd als een bron van variatie in translocatiesnelheid, de onderzoekers verwachtten dat de enige bron van variatie het effect van thermische beweging zou zijn. De minuscule virusmoleculen stoten constant tegen de watermoleculen waarin ze zijn ondergedompeld. Een paar willekeurige thermische schoppen vanaf de achterkant zouden het virus versnellen als het door de porie gaat. Een paar schoppen van voren zouden het vertragen.

De experimenten toonden aan dat, hoewel thermische beweging veel van de variatie in translocatiesnelheid verklaarde, het verklaarde niet alles. Tot grote verbazing van de onderzoekers, ze vonden een andere bron van variatie die toenam wanneer de spanning over de porie werd verhoogd.

"We dachten dat de fysica glashelder zou zijn, " zei Jay Tang, universitair hoofddocent natuurkunde en techniek bij Brown en een van de co-auteurs van de studie. "Je hebt dit stijve [virus] met een goed gedefinieerde diameter en grootte en je zou een heel duidelijk signaal verwachten. Het blijkt dat we hebben wat raadselachtige natuurkunde gevonden die we zelf maar gedeeltelijk kunnen verklaren."

De onderzoekers kunnen niet met zekerheid zeggen wat de oorzaak is van de variatie die ze hebben waargenomen, maar ze hebben een paar ideeën.

"Er is voorspeld dat, afhankelijk van waar [een object] zich in de porie bevindt, er kan harder of zwakker aan worden getrokken, " zei McMullen. "Als het zich in het midden van de porie bevindt, het trekt een beetje zwakker dan wanneer het precies op de rand is. Dat is voorspeld, maar nooit experimenteel geverifieerd. Dit zou een bewijs kunnen zijn van dat gebeuren, maar we doen nog steeds vervolgwerk."

Op weg naar een nanopore-sequencer en meer

Een beter begrip van de translocatiesnelheid zou de nauwkeurigheid van nanopore-sequencing kunnen verbeteren, zegt McMullen. Het zou ook nuttig zijn bij de cruciale taak van het meten van de lengte van DNA-strengen. "Als je de translocatiesnelheid kunt voorspellen, "McMullen zei, "dan kun je gemakkelijk de lengte van het DNA krijgen van hoe lang de translocatie was."

Het onderzoek hielp ook om andere aspecten van het translocatieproces aan het licht te brengen die nuttig zouden kunnen zijn bij het ontwerpen van toekomstige apparaten. De studie toonde aan dat de elektrische stroom de neiging heeft om de virussen eerst naar de porie uit te lijnen, maar op momenten dat ze niet in een rij staan, ze hebben de neiging om rond te stuiteren op de rand van de porie totdat thermische beweging ze uitlijnt om er doorheen te gaan. Echter, toen de spanning te hoog werd, de thermische effecten werden onderdrukt en het virus bleef aan het membraan plakken. Dat suggereert een goede plek in spanning waar headfirst translocatie het meest waarschijnlijk is.

Niets van dit alles is direct waarneembaar - het systeem is gewoon te klein om in actie te zien. Maar de onderzoekers konden afleiden wat er gebeurde door te kijken naar kleine veranderingen in de stroom door de porie.

"Als de virussen missen, ze ratelen in het rond en we zien deze kleine bultjes in de stroming, "zei Stein. "Dus met deze kleine bultjes, we beginnen een idee te krijgen van wat het molecuul doet voordat het er doorheen glijdt. Normaal gesproken zijn deze sensoren blind voor alles wat er gebeurt totdat het molecuul er doorheen glijdt."

Dat was met DNA niet waar te nemen. De slapheid van het DNA-molecuul zorgt ervoor dat het door een porie kan gaan in een gevouwen configuratie, zelfs als het niet frontaal is uitgelijnd. Maar omdat het virus stijf is, het kan niet vouwen om door te gaan. Dat stelde de onderzoekers in staat om die contactdynamiek te isoleren en te observeren.

"Deze virussen zijn uniek, ' zei Stein. 'Het zijn net perfecte kleine maatstaven.'

Naast het licht werpen op de basisfysica, het werk kan ook een andere toepassing hebben. Hoewel het fd-virus zelf onschadelijk is, de bacteriën die het infecteert - e. coli — niet. Op basis van dit werk, het zou mogelijk zijn om een ​​nanopore-apparaat te bouwen voor het detecteren van de aanwezigheid van fd, en bij volmacht, e. coli. Andere gevaarlijke virussen, waaronder Ebola en Marburg, delen dezelfde staafachtige structuur als fd.

"Dit kan een gemakkelijke manier zijn om deze virussen te detecteren, "Zei Tang. "Dus dat is een andere mogelijke toepassing hiervoor."