Tegen de tijd dat ze twee zijn, de meeste kinderen hebben het respiratoir syncytieel virus (RSV) gehad en hadden symptomen die niet erger waren dan een zware verkoudheid. Maar voor sommige kinderen vooral te vroeg geboren baby's en kinderen met onderliggende gezondheidsproblemen, RSV kan leiden tot longontsteking en bronchitis - waarvoor ziekenhuisopname nodig kan zijn en op lange termijn gevolgen kan hebben.

Een nieuwe techniek voor het bestuderen van de structuur van het RSV-virion en de activiteit van RSV in levende cellen zou onderzoekers kunnen helpen de geheimen van het virus te ontrafelen. inclusief hoe het cellen binnenkomt, hoe het repliceert, hoeveel genomen het in zijn gastheren inbrengt - en misschien waarom bepaalde longcellen relatief ongedeerd aan de infectie ontsnappen. Dat zou wetenschappers informatie kunnen verschaffen die ze nodig hebben om nieuwe antivirale medicijnen te ontwikkelen en misschien zelfs een vaccin om ernstige RSV-infecties te voorkomen.

"We willen tools ontwikkelen waarmee we kunnen achterhalen hoe het virus echt werkt, zei Philip Santangelo, een universitair hoofddocent bij de Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering aan Georgia Tech en Emory University. "We moeten de infectie echt in een enkele levende cel kunnen volgen zonder te beïnvloeden hoe het virus zijn gastheren infecteert, en deze technologie zou ons in staat moeten stellen om dat te doen."

Het onderzoek werd ondersteund door het National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences en online gepubliceerd voordat het gedrukt werd in het tijdschrift ACS Nano op 30 dec. 2013. Terwijl RSV het eerste doelwit voor het werk zal zijn, de onderzoekers geloven dat de beeldvormingstechniek die ze hebben ontwikkeld kan worden gebruikt om andere RNA-virussen te bestuderen, waaronder griep en ebola.

"We hebben aangetoond dat we het genoom kunnen taggen met behulp van onze sondes, ", legde Santangelo uit. "Wat we hiervan hebben geleerd, is dat het genoom in het virion wordt opgenomen, en dat de gecreëerde virusdeeltjes besmettelijk zijn. We waren in staat om sommige aspecten van het virusdeeltje zelf te karakteriseren met superresolutie, tot 20 nanometer, met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) beeldvorming."

RSV kan moeilijk te bestuderen zijn. Voor een ding, het besmettelijke deeltje kan verschillende vormen aannemen, variërend van 10-micron filamenten tot gewone bollen. Het virus kan meer dan één genoom in de gastheercellen inbrengen en de RNA-oriëntatie en -structuur zijn verstoord, waardoor het moeilijk te karakteriseren is.

Het onderzoeksteam, waaronder wetenschappers van de Vanderbilt University en Emory University, gebruikte een sondetechnologie die snel hecht aan RNA in cellen. De sonde gebruikt meerdere fluoroforen om de aanwezigheid van het virale RNA aan te geven, waardoor de onderzoekers kunnen zien waar het naartoe gaat in gastheercellen - en kijken hoe infectieuze deeltjes de cellen verlaten om de infectie te verspreiden.

"Het kunnen zien van het genoom en het nageslacht-RNA dat uit het genoom komt met de sondes die we gebruiken, geeft ons echt veel meer inzicht in de replicatiecyclus, "Zei Santangelo. "Dit geeft ons veel meer informatie over wat het virus werkelijk doet. Als we de invoer kunnen visualiseren, assemblage en replicatie van het virus, dat zou ons in staat stellen te beslissen wat we gaan doen om het virus te bestrijden."

Het onderzoek was afhankelijk van een nieuwe methode voor het labelen van RNA-virussen met behulp van multi-labeled tetravalent RNA imaging probes (MTRIPS). De probes bestaan ​​uit een chimere combinatie van DNA- en RNA-oligonucleotide die intern is gelabeld met fluoroforen die tetravelent zijn gecomplexeerd met neutravidine. De chimere combinatie werd gebruikt om de sondes te helpen de cellulaire afweer te ontwijken.

"Er zijn veel sensoren in de cel die zoeken naar vreemd RNA en vreemd DNA, maar naar de cel, deze sonde lijkt nergens op, " legde Santangelo uit. "De cel ziet het nucleïnezuur niet als vreemd."

Geïntroduceerd in cellen, de sondes diffunderen snel door een cel die is geïnfecteerd met RSV en binden aan het RNA van het virus. Hoewel stevig gebonden, de sonde heeft geen invloed op de normale activiteiten van het virus en stelt onderzoekers in staat de activiteit dagenlang te volgen met behulp van standaard microscopietechnieken. De MTRIPS kan worden gebruikt als aanvulling op andere sondetechnologie, zoals GFP en gouden nanodeeltjes.

Het werk van afgestudeerde student Eric Alonas om het virus te concentreren was essentieel voor het project, zei Santangelo. De concentratie moest gebeuren zonder de besmettelijkheid van het virus nadelig te beïnvloeden, die van invloed zou zijn geweest op het vermogen om gastheercellen binnen te gaan.

"Het kostte nogal wat werk om de juiste technieken te krijgen om de RSV te concentreren, " zei hij. "Nu kunnen we veel besmettelijke virussen maken die gelabeld zijn en kunnen worden opgeslagen, zodat we het kunnen gebruiken wanneer we dat willen."

Om de voortgang van de infectie in individuele cellen te bestuderen, stonden de onderzoekers voor een andere uitdaging:levende cellen bewegen rond, en het volgen ervan bemoeilijkt het onderzoek. Om die beweging aan te pakken, het laboratorium van Thomas Barker - ook in de afdeling Coulter - gebruikte fibronectine met micropatroon op glas om "eilanden" van 50 micron te creëren die de cellen bevatten tijdens het onderzoek.

Een van de mysteries die de onderzoekers willen aanpakken, is waarom bepaalde longcellen ernstig geïnfecteerd zijn, terwijl andere lijken te ontsnappen aan nadelige gevolgen.

"Als je naar een veld met cellen kijkt, je ziet enorme verschillen van cel tot cel, en dat is iets dat helemaal niet wordt begrepen, "Zei Santangelo. "Als we erachter kunnen komen waarom sommige cellen exploderen met virus en andere niet, misschien kunnen we een manier bedenken om de slechte te helpen meer op de goede te lijken."

Naast de al genoemde, het onderzoeksteam omvatte James Crowe, hoogleraar kindergeneeskunde aan de Vanderbilt University; Elizabeth Wright, assistent-professor aan de School of Medicine aan de Emory University; Daryll Vanover, Jeenah Jung, Chiara Zurla, Jonathan Kirschman, Vincent Fiore, en Alison Douglas van de Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering aan Georgia Tech en Emory University; Aaron Lifland en Manasa Gudheti van Vutara Inc. in Salt Lake City, en Hong Yi van de Emory University School of Medicine.

Een van de uitdagingen bij het bestuderen van RSV is het handhaven van zijn activiteit in het laboratorium - een probleem dat ouders van jonge kinderen niet delen.

"Als je dit virus in het lab behandelt, je moet altijd oppassen dat het zijn besmettelijkheid verliest, " merkte Santangelo op. "Maar als je een kamer vol kinderen neemt die niet zijn geïnfecteerd en één geïnfecteerd kind de kamer binnenlaat, 15 minuten later zijn alle kinderen besmet."