Wetenschap
Nieuwe methode voor massaproductie van recombinante eiwitten maakt gebruik van mononatriumglutamaat
Voor de massaproductie van recombinante eiwitten met behulp van "fabrieken" van gistcellen is methanol nodig, een verbinding die veilig moet worden gehanteerd, het risico met zich meebrengt dat deze in brand vliegt en soms schadelijke bijproducten produceert. Onderzoekers van het Department of Biochemistry (BC), Indian Institute of Science (IISc), hebben nu een alternatief, veiliger proces ontwikkeld dat in plaats daarvan afhankelijk is van een algemeen voedingsadditief genaamd mononatriumglutamaat (MSG).
Recombinante eiwitten, zoals vaccinantigenen, insuline en monoklonale antilichamen, worden in massa geproduceerd door gemodificeerde bacteriële, virale of zoogdiercellen in grote bioreactoren te laten groeien. Het meest gebruikte organisme is de gist Pichia pastoris (nu Komagataella phaffii genoemd). Het bevat een unieke promotor:een specifiek gengebied dat kan worden geactiveerd door methanol. Deze promotor codeert voor een enzym genaamd alcoholoxidase (AOX).
Om een recombinant eiwit massaal te produceren, wordt het gen dat voor dat eiwit codeert, direct naast de AOX-promoter in het gistgenoom gesplitst. De gistcellen krijgen vervolgens glycerol of glucose als koolstofbron. Zodra er voldoende cellen zijn gevormd, wordt methanol toegevoegd, wat vervolgens de AOX-promoter activeert, en de cellen beginnen het recombinante eiwit in grote hoeveelheden te produceren.
De meeste industrieën gebruiken dit door methanol geïnduceerde proces voor de productie van recombinante eiwitten. Methanol is echter zeer brandbaar en gevaarlijk en vereist strenge veiligheidsmaatregelen, zegt PN Rangarajan, hoogleraar aan BC en corresponderende auteur van het onderzoek gepubliceerd in Mbiotic Cell Factories . Methanol wordt ook gemetaboliseerd tot waterstofperoxide, wat oxidatieve stress in de gistcellen kan veroorzaken of de recombinante eiwitten kan beschadigen.
Om dit probleem op te lossen heeft Trishna Dey, een voormalige Ph.D. student aan BC, op zoek gegaan naar alternatieven. Na uitgebreid onderzoek ontdekte het team dat mononatriumglutamaat (MSG), een door de USFDA goedgekeurd voedingsadditief, een andere promotor in het gistgenoom kan activeren die codeert voor een enzym genaamd fosfoenolpyruvaatcarboxykinase (PEPCK). Het activeren van deze promotor met MSG leidde tot een eiwitproductie die vergelijkbaar is met de methanolactivering van de AOX-promotor.
Het optimaliseren van het celkweekmedium voor dit nieuwe en nog niet geteste proces was een uitdaging, zegt Neetu Rajak, eerste auteur en Ph.D. student aan B.C. Lange tijd groeiden de gistcellen slecht in schudflessen en produceerden ze heel weinig recombinant eiwit. "Er was een tijd dat we het bijna opgaven omdat we dachten dat het niet zou werken", herinnert Rangarajan zich.
De groep kwam er uiteindelijk achter dat het gebruik van MSG alleen niet genoeg was. Vedanth Bellad en Yash Sharma, projectassistenten bij BC en co-auteurs, leggen uit dat ze probeerden de cultuur aan te vullen met verschillende andere verbindingen, totdat één uiteindelijk de oplossing was:ethanol.
Door ethanol toe te voegen, groeiden de cellen sneller, waardoor de biomassa en de geproduceerde hoeveelheid recombinant eiwit toenamen. Ethanol is ook veiliger voor gistcellen vergeleken met methanol, omdat het bij de afbraak geen giftige bijproducten produceert.
Om hun proces te testen, probeerde het team het SARS-CoV-2-receptorbindende domein te produceren – een veelgebruikt vaccinantigeen dat met succes tot expressie is gebracht in gist- en zoogdiercellen. Ze ontdekten dat hun nieuwe expressiesysteem twee keer zoveel antigeen produceerde vergeleken met het door methanol geïnduceerde proces.
De onderzoekers hopen dat dit nieuwe en inheemse expressiesysteem in de biotechindustrie kan worden gebruikt voor de massaproductie van waardevolle eiwitten, waaronder melk- en ei-eiwitten, babyvoedingssupplementen en nutraceuticals, naast therapeutische moleculen.