Toen wetenschappers de structuur van het spike-eiwit moesten visualiseren, die coronavirussen gebruiken om menselijke cellen te infiltreren, ze wendden zich tot cryo-elektronenmicroscopie. Een van de krachtigste beeldvormingstools in het arsenaal van een onderzoeker, cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) kan eiwitten visualiseren, pathogenen en diverse celcomponenten bijna tot aan hun individuele atomen.

Maar het voorbereiden van monsters voor cryo-EM is een omslachtig proces dat afhankelijk is van ethaan - een krachtig koelmiddel in vloeibare vorm, en een ontvlambaar gas bij kamertemperatuur dat vatbaar is voor explosies.

Een nieuwe studie gepubliceerd op 7 september in de International Union of Crystallography Journal toont aan dat cryo-EM-monsters kunnen worden bereid met een veiliger en goedkoper koelmiddel - vloeibare stikstof - en deze monsters kunnen nog scherpere beelden produceren dan die bereid met ethaan. De bevindingen zetten conventionele wijsheid in de war die teruggaat tot de jaren 80, en kan de veiligheid en kwaliteit van cryo-EM verbeteren.

"Ethaan is geen standaard chemische stof voor laboratoria. Het is gevaarlijk, en het gebruik ervan voegt extra complicaties toe, " zei senior auteur Robert Thorne, hoogleraar natuurkunde aan het College of Arts and Sciences en een Weiss Presidential Fellow. "Vloeibare stikstof is het koelmiddel bij uitstek."

Cryo-EM werkt door elektronen af ​​te vuren door moleculen die flitsend bevroren zijn in een glasachtige laag water, het vastleggen van meerdere vage beelden van de moleculen in het ijs. Geavanceerde software kan die wazige clips vaak samenvatten tot één helder 3D-beeld, maar niet consequent.

Een deel van de wazigheid komt van het monster zelf. Wanneer het water dat de moleculen omhult te langzaam afkoelt, het vormt ijskristallen die het beeld degraderen. Wetenschappers omzeilen dit probleem door ethaan te gebruiken om het water zo snel af te koelen dat het in een glazige, kristalvrij blad. Maar zo'n snelle bevriezing zet het laken onder druk, die rust op een dunne film van goud. Wanneer de elektronenstraal de plaat raakt, stress zorgt ervoor dat de moleculen bewegen, vervaging van het uiteindelijke beeld in een fenomeen dat bekend staat als bundelgeïnduceerde beweging.

"We hebben twee tegengestelde factoren, "Zei Thorne. "We willen de monsters snel afkoelen, om de vorming van ijskristallen te voorkomen en om de biologische structuur van de moleculen vast te leggen. Maar we willen de monsters ook zo langzaam mogelijk afkoelen om hun beweging tijdens de beeldvorming te minimaliseren."

Ethaan koelt monsters zeer snel af. Maar onderzoekers moeten vloeibare stikstof gebruiken om ethaangas in vloeistof om te zetten. en vervolgens meer vloeibare stikstof om monsters op te slaan nadat ze zijn ingevroren. "Ethaan is omslachtig, het is gevaarlijk, en, uiteindelijk, de monsters komen sowieso in vloeibare stikstof terecht, ' zei Thorne.

Vloeibare stikstof koelt ongeveer 50 keer langzamer af dan die van ethaan, volgens rapporten van de afgelopen 40 jaar, en dat is niet snel genoeg om water om te zetten in een glazige plaat. Maar anno 2006, Thorne's onderzoeksgroep ontdekte dat de belangrijkste factor die stikstof afremde, was dat koud gas boven het oppervlak van de vloeistof zweefde. die kleine monsters afkoelde voordat ze bij de vloeistof kwamen.

Thorne's bedrijf, MiTeGen, uiteindelijk een geautomatiseerd koelinstrument ontwikkeld voor röntgenkristallografie - een andere methode die wordt gebruikt om eiwitmoleculen in beeld te brengen - dat het koude gas verwijdert net voordat een monster in stikstof wordt ondergedompeld, en ontdekte dat de afkoelingssnelheden slechts zes keer langzamer waren dan die van ethaan. MiTeGen-medewerkers pasten vervolgens hun koelinstrument aan voor cryo-EM-monsters en werkten samen met medewerkers van het Cornell Center for Materials Research en postdoctoraal medewerker Jonathan Clinger om cryo-EM-gegevens te verzamelen en te analyseren.

Zoals de nieuwe studie meldt, stikstof koelt af met de perfecte snelheid voor cryo-EM-monstervoorbereiding - snel genoeg om significante ijskristalvorming te voorkomen, maar langzaam genoeg om later door de bundel veroorzaakte beweging te verminderen.

"Ethaan is overdreven, "Zei Thorne. "Voor snelheid heb je geen je krijgt wazige beelden met door bundels veroorzaakte beweging, en dat is problematischer dan alle ijskristallen die zich vormen door iets langzamere afkoeling."

En volledig vloeibare stikstofkoeling, Thorne zei, zal cryo-EM-workflows vereenvoudigen, het verwijderen van de extra stappen die nodig zijn voor ethaan en het gemakkelijker maken om geautomatiseerde koelinstrumenten te ontwerpen die voldoen aan de huidige veiligheidsnormen voor laboratoria.

"Dit is een mooie illustratie van hoe academische basiswetenschap - kijken naar hoe kleine objecten afkoelen en hoe ijs zich daarin vormt - kan leiden tot praktische oplossingen en commerciële producten."