Experts in optische fysica hebben een nieuwe manier ontwikkeld om in levende cellen gedetailleerder te kijken met behulp van bestaande microscopietechnologie en zonder dat er vlekken of fluorescerende kleurstoffen aan toegevoegd hoeven te worden.

Omdat individuele cellen bijna doorschijnend zijn, microscoopcamera's moeten uiterst subtiele verschillen detecteren in het licht dat door delen van de cel gaat. Die verschillen staan ​​bekend als de fase van het licht. Camerabeeldsensoren worden beperkt door de hoeveelheid lichtfaseverschil die ze kunnen detecteren, dynamisch bereik genoemd.

"Om meer details te zien met dezelfde beeldsensor, we moeten het dynamisch bereik vergroten zodat we kleinere faseveranderingen van licht kunnen detecteren, " zei universitair hoofddocent Takuro Ideguchi van het University of Tokyo Institute for Photon Science and Technology.

Het onderzoeksteam ontwikkelde een techniek om twee opnamen te maken om grote en kleine veranderingen in de lichtfase afzonderlijk te meten en ze vervolgens naadloos met elkaar te verbinden om een ​​zeer gedetailleerd eindbeeld te creëren. Ze noemden hun methode adaptive dynamic range shift kwantitatieve fasebeeldvorming (ADRIFT-QPI) en publiceerden onlangs hun resultaten in Licht:wetenschap en toepassingen .

"Onze ADRIFT-QPI-methode heeft geen speciale laser nodig, geen speciale microscoop of beeldsensoren; we kunnen levende cellen gebruiken, we hebben geen vlekken of fluorescentie nodig, en er is zeer weinig kans op fototoxiciteit, ' zei Ideguchi.

Fototoxiciteit verwijst naar het doden van cellen met licht, wat een probleem kan worden bij sommige andere beeldvormingstechnieken, zoals fluorescentiebeeldvorming.

Kwantitatieve fasebeeldvorming zendt een puls van een plat vel licht naar de cel, meet vervolgens de faseverschuiving van de lichtgolven nadat ze door de cel zijn gegaan. Computeranalyse reconstrueert vervolgens een beeld van de belangrijkste structuren in de cel. Ideguchi en zijn medewerkers hebben eerder andere methoden ontwikkeld om kwantitatieve fasemicroscopie te verbeteren.

Kwantitatieve fasebeeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van individuele cellen, omdat het onderzoekers in staat stelt gedetailleerde metingen te doen, zoals het volgen van de groeisnelheid van een cel op basis van de verschuiving in lichtgolven. Echter, het kwantitatieve aspect van de techniek heeft een lage gevoeligheid vanwege de lage verzadigingscapaciteit van de beeldsensor, dus het volgen van nanodeeltjes in en rond cellen is niet mogelijk met een conventionele benadering.

De nieuwe ADRIFT-QPI-methode heeft de beperking van het dynamisch bereik van kwantitatieve fasebeeldvorming overwonnen. Tijdens ADRIFT-QPI, de camera maakt twee opnamen en produceert een eindbeeld dat zeven keer zo gevoelig is als traditionele kwantitatieve fasemicroscopiebeelden.

De eerste belichting wordt geproduceerd met conventionele kwantitatieve fasebeeldvorming - een vlak lichtvel wordt naar het monster gepulseerd en de faseverschuivingen van het licht worden gemeten nadat het door het monster is gegaan. Een computerbeeldanalyseprogramma ontwikkelt een afbeelding van het monster op basis van de eerste belichting en ontwerpt vervolgens snel een gebeeldhouwd golffront van licht dat dat beeld van het monster weerspiegelt. Een afzonderlijk onderdeel, een golffrontvormend apparaat genaamd, genereert vervolgens deze "sculptuur van licht" met licht van hogere intensiteit voor sterkere verlichting en pulseert het naar het monster voor een tweede belichting.

Als de eerste belichting een beeld produceerde dat een perfecte weergave was van het monster, de op maat gemaakte lichtgolven van de tweede belichting zouden het monster in verschillende fasen binnenkomen, door het monster gaan, dan tevoorschijn komen als een vlakke plaat van licht, waardoor de camera niets anders ziet dan een donker beeld.

"Dit is het interessante:we wissen het beeld van het monster een beetje. We willen bijna niets zien. We heffen de grote structuren op zodat we de kleinere tot in detail kunnen zien, ' legde Ideguchi uit.

In werkelijkheid, de eerste belichting is onvolmaakt, dus de gebeeldhouwde lichtgolven verschijnen met subtiele faseafwijkingen.

De tweede belichting onthult kleine verschillen in de lichtfase die "verbleekt" werden door grotere verschillen in de eerste belichting. Dit resterende kleine faseverschil in licht kan worden gemeten met een verhoogde gevoeligheid vanwege de sterkere verlichting die bij de tweede belichting wordt gebruikt.

Aanvullende computeranalyse reconstrueert een eindbeeld van het monster met een uitgebreid dynamisch bereik van de twee meetresultaten. In proof-of-concept demonstraties, onderzoekers schatten dat de ADRIFT-QPI beelden produceert met een zeven keer grotere gevoeligheid dan conventionele kwantitatieve fasebeeldvorming.

Ideguchi zegt dat het echte voordeel van ADRIFT-QPI het vermogen is om kleine deeltjes in de context van de hele levende cel te zien zonder dat er labels of vlekken nodig zijn.

"Bijvoorbeeld, kleine signalen van deeltjes op nanoschaal zoals virussen of deeltjes die binnen en buiten een cel bewegen, kunnen worden gedetecteerd, die gelijktijdige observatie van hun gedrag en de toestand van de cel mogelijk maakt, ' zei Ideguchi.