De eiwitten waaruit onze cellen bestaan, bevatten een hele wereld van informatie, die ons, wanneer ontgrendeld, inzicht kan geven in de oorsprong van veel essentiële biologische verschijnselen. Deze informatie wordt verzameld met behulp van een analytische techniek die bekend staat als 'single-cell proteomics', waarbij een eencellige analyse wordt uitgevoerd om de kenmerken van individuele cellen op hun eiwitniveau te observeren. In de loop der jaren hebben wetenschappers eencellige proteomics gebruikt op het gebied van kankergenomica, celdifferentiatie en weefselontwikkeling. De huidige proteomics-technieken hebben echter te lijden van een lage herstelsnelheid van eiwitmonsters, een lage doorvoer en een gebrek aan veelzijdigheid.

Gelukkig heeft een team van onderzoekers uit Japan en de VS onder leiding van assistent-professor Takeshi Masuda van de Kumamoto University in Japan een oplossing voor deze problemen gevonden. In een recente studie die op 11 juli 2022 online beschikbaar is gesteld en gepubliceerd in Analytical Chemistry op 26 juli 2022 introduceerde het team een ​​eenvoudige maar zeer efficiënte monstervoorbereidingsmethode voor eencellige proteomics genaamd "waterdruppel-in-olie-methode" (WinO). De techniek maakt in zijn voordeel gebruik van de onmengbaarheid van water met olie/organisch oplosmiddel om eiwitmonsters te bereiden met minimaal verlies en verhoogde kans op monsterterugwinning.

"Om single cell-proteomics efficiënter te maken, moeten we ofwel het eiwitmonster amplificeren of ervoor zorgen dat niets ervan verloren gaat tijdens de monstervoorbereiding. Omdat we niet de middelen hadden om de eerste te doen, was het cruciaal dat we de absorptie verminderden verliezen tijdens monstervoorbereidingsstappen zoals monsteroverdracht", legt Dr. Masuda uit. "De WinO-techniek vermindert niet alleen monsterverlies door adsorptie, maar zorgt ook voor een betere doorvoer in vergelijking met conventionele methoden."

Voor het WinO-proces bereidde het team eerst een extractiebuffer voor door één microliter water te mengen met oppervlakteactieve faseoverdracht (die de oplosbaarheid van hydrofobe eiwitten verhogen) en hydrofobe carboxyl-gecoate nanomagnetische kralen. Dit mengsel werd vervolgens in 50 microliter ethylacetaat gedruppeld.

De volgende stap was eiwitextractie, die werd uitgevoerd door celdruppels van de celsorteerder toe te voegen aan de ethylacetaat-waterdruppelcombinatie en deze in een centrifuge te draaien om het eiwit in de waterdruppel te laten ophopen. Na de extractie werd het monster gedigereerd met behulp van een eiwit-enzym, Lys-C, en gelabeld met behulp van een "tandem mass tag"-reagens. Het geëxtraheerde, verteerde gelabelde monster werd vervolgens gezuiverd en teruggewonnen voor eencellige analyse en proteomische profielen.

Om de werkzaamheid van de WinO-methode te vergelijken met conventionele methoden, heeft het team ook monsters voorbereid met behulp van de standaard in-solution digestie (ISD) -methode en proteomische analyse uitgevoerd. Ze ontdekten dat de WinO-methode leidde tot een 10-voudige toename van eiwit- en peptideherstel in vergelijking met ISD. Deze opmerkelijke verbetering werd toegeschreven aan een kleiner contactoppervlak tussen de extractieoplossing en de monstercontainer.

Om de gevoeligheid van beide methoden te analyseren, vergeleek het team ook de verkregen proteomische profielen. Ze observeerden een hoge correlatie tussen proteomische profielen die werden verkregen voor 100 cellen met WinO en die voor 10.000 cellen met ISD. Bovendien heeft het team met succes 462 eiwitten gekwantificeerd met behulp van WinO, wat aantoont dat het een veel hogere doorvoer- en extractie-efficiëntie opleverde dan conventionele technieken.

Het verbeterde eiwitherstel en identificatievermogen dat door WinO wordt geboden, zou het mogelijk maken om de eiwitexpressie van kankercellen van naderbij te bekijken en een beter begrip te krijgen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan resistentie tegen kankermedicijnen. Verder kan WinO semi-geautomatiseerd worden met behulp van een vloeistofverwerkingsrobot, waardoor het geschikt is voor snelle verwerking van monsters met grote capaciteit. "Ons onderzoek zou wetenschappers in staat kunnen stellen om proteomics uit te voeren op zeldzame en beperkte monsterhoeveelheden en een nieuw perspectief te bieden op eiwitexpressie, wat mogelijkheden opent voor het ontdekken van nieuwe biologische fenomenen", concludeert Dr. Masuda. + Verder verkennen

Snelle en gemakkelijke eiwitanalyse van sporen van celmonsters