Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om verbindingen te scheiden en te identificeren. Het is een soort kolomchromatografie die afhankelijk is van verschillende polariteiten van verbindingen in een oplossing om ze te scheiden. HPLC verschilt van standaard kolomchromatografie omdat het druk gebruikt om de oplossing sneller door de kolom te forceren en daardoor snellere, en soms meer accurate, resultaten oplevert. Het doel is om verbindingen in de kolom te scheiden en ze afzonderlijk te laten afsluiten.

Coelution

Vanwege de snelheid van HPLC en het vertrouwen op verschillende polariteiten van verbindingen, twee verbindingen met vergelijkbare structuur en polariteiten kan het chromatografieapparaat op hetzelfde tijdstip of bijna tegelijkertijd verlaten. Dit staat bekend als coelution. Coelution maakt het bepalen van welk gedeelte van het mengsel op welk punt moeilijk wordt geëlueerd.

Geadsorbeerde verbindingen

HPLC gebruikt meestal een glazen kolom gevuld met kralen gemaakt van verschillende materialen. De mengsels die door de kolom worden gedwongen, hebben chemicaliën die met verschillende sterkten aan de kralen binden. De sterkte van de binding, die afhangt van de overeenkomst in polariteit, bepaalt hoe lang de chemische stof aan de hiel zal binden voordat deze wordt vrijgegeven. Sommige verbindingen binden zo sterk dat ze in essentie nooit vrijkomen uit de korrels in de kolom en worden nooit gemeten in de oplossing die de kolom verlaat.

Kostenplaatje

Typische laboratoriumscheidingstechnieken omvatten het ontwikkelen van een assay, of scheidingsmethode, en vervolgens die test te implementeren om afzonderlijke verbindingen van een oplossing te scheiden. Dit resulteert echter meestal in meerdere oplossingen die ook procedures moeten ondergaan, wat leidt tot een exponentiële toename van de complexiteit. Hoewel HPLC dit proces vaak kan vereenvoudigen en versnellen, kunnen de kosten voor het ontwikkelen van een HPLC-apparaat enorm worden. Het ontwikkelen van een HPLC-apparaat, hoewel veel efficiënter, is veel duurder dan het ontwikkelen van andere testen voor het scheiden van verbindingen. Dit maakt het financieel niet haalbaar voor veel kleine particuliere laboratoria.

Complexiteit

HPLC wordt niet alleen gebruikt voor het scheiden van eenvoudige verbindingen, het wordt ook gebruikt om specifieke eiwitten uit een celmengsel te isoleren. In dit geval worden de korrels in de kolom gewoonlijk gecoat met een antilichaam dat specifiek is voor het eiwit dat u moet verzamelen. De eiwitten binden de antilichamen en de overblijvende oplossing wordt door de kolom gevoerd, vervolgens worden de eiwitten met een andere oplossing afgegeven en verzameld. Hiervoor is een zeer bekwame technicus vereist om de kolom te allen tijde te bewaken en ervoor te zorgen dat het proces precies volgens plan verloopt.