Polyacrylamidegelelektroforese maakt scheiding met hoge resolutie mogelijk van eiwitten die zijn geëxtraheerd uit biologische monsters, maar er is meer dan één dag voorbehandeling nodig om de gescheiden eiwitten die in de gel zijn gevangen, terug te winnen voor detectie met massaspectrometrie. BAC-DROP, onze nieuwe elektroforesetechnologie, maakt gebruik van een oplosbare vorm van polyacrylamidegel, waardoor de voorbehandeling van het monster in ongeveer vijf uur kan worden voltooid. De ontwikkelde technologie zal de snelle diagnose van virussen en ziekte-eiwitmarkers mogelijk maken.

Massaspectrometrie (MS) is een krachtige methode voor biomarkeranalyse omdat het een zeer gevoelige en nauwkeurige meting van doelmoleculen in klinische monsters mogelijk maakt. De toepassing van MS op klinische diagnose, zoals neonatale metabole screening, vordert met een focus op metabolietmarkers. MS-meting van eiwitten wordt momenteel voornamelijk gebruikt voor nieuwe marker-ontdekkingsstudies, maar er is een groeiende belangstelling voor de toepassing ervan in de diagnose van klinische markers als alternatief voor immunoassays.

MS-gebaseerde kwantificering van eiwitbiomarkers wordt voornamelijk uitgevoerd door een bottom-up benadering met behulp van peptidefragmenten die zijn verkregen door enzymatische eiwitdigestie met trypsine. Standaard verteringsprotocollen vereisen een reactietijd van meer dan 20 uur, wat een snelheidsbeperkende factor is in workflows voor monstervoorbereiding.

Hoewel eiwitkwantificering door MS zeer gevoelig is, plasma- en serumproteoom zijn zeer complex, en interferentie door andere componenten vormt een grote uitdaging. Voor zeer nauwkeurige detectie van doelmarkeringen, benaderingen voor pre-verwijdering van belangrijke serumeiwitcomponenten zoals albumine of selectieve verrijking van doelmarkers met behulp van antilichaamkolommen zijn gemeld, maar het off-target effect op kwantitatieve resultaten en de moeilijkheid om meerdere monsters te verwerken, blijven obstakels.

In dit onderzoek, we hebben ons gericht op oplosbare polyacrylamidegels met N, N'-Bis(acryloyl)cystamine (BAC) als crosslinker om deze problemen op te lossen. BAC verknoopte polyacrylamidegels lossen gemakkelijk op door reductiebehandeling, waardoor het herstel van eiwitten die in de oplossing zijn ontsnapt, mogelijk is. We vonden dat de teruggewonnen eiwitten geschikt waren voor snelle vertering van trypsine onder hoge temperatuuromstandigheden, en we zijn erin geslaagd een monstervoorbereidingsmethode met hoge doorvoer vast te stellen voor op MS gebaseerde kwantificering van biomarkers, die we BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins) noemden.

Proteoomfractionering met hoge resolutie met BAC-DROP is bijzonder effectief voor MS-kwantificering van gerichte sporenmarkereiwitten die zijn afgeleid van klinische monsters. Door BAC-DROP te introduceren in de op MS gebaseerde kwantificatieworkflow van de inflammatoire biomarker C-reactief proteïne (CRP), we waren in staat om de voorbehandeling van het monster in slechts 5 uur te voltooien en hebben met succes CRP gekwantificeerd uit een humaan serummonster van 0,5 L. We zijn er ook in geslaagd een serologische diagnose van hepatitis B-virus (HBV) infectie te stellen door HBsAg-kwantificering in combinatie met BAC-DROP en MS. Onlangs, de belangstelling voor MS-diagnose van virale infecties neemt snel toe, zoals blijkt uit de diagnose COVID-19. De methode voor het voorbereiden van monsters met een hoge doorvoer door BAC-DROP die in dit onderzoek wordt getoond, is niet alleen van toepassing op HBV, maar ook op andere monsters van infectieuze virale ziekten.