Zoë Fisher en Katarina Koruza van het ESS Deuteration and Macromolecular Crystallization (DEMAX) Support lab en Lund University hebben dampdiffusiemethoden gebruikt om grote eiwitkristallen te kweken voor neutronentechnieken als onderdeel van het Crystal Growth-werkpakket van SINE2020. Echter, evenals het kunnen groeien van kristallen die groot genoeg zijn voor deze technieken, ze willen ze ook gedeutereerd maken. Deuterated versies zorgen voor een verbeterde signaal-ruisverhouding, verminderde onsamenhangende achtergrond en het gebruik van contrastvariatiemethoden.

Het team heeft geprobeerd om grote kristallen te maken van verschillende eiwitten, waaronder het membraaneiwit Tomato thymidine kinase (TOTK1) en Superoxide dismutase (bSOD), dat in alle organismen aanwezig is en betrokken is bij het verouderingsproces. Echter, hoewel ze erin slaagden mooie kristallen te laten groeien, waren ze gewoon niet groot genoeg - minder dan 0,1 mm3.

Maar Zoë en Katarina hebben veel meer succes gehad met menselijke koolzuuranhydrase (HCA) eiwitten. Het HCA IX-eiwit in het bijzonder is betrokken bij kankermetastasen en is naar voren gekomen als een mogelijk doelwit voor kankerdetectie, in beeld brengen, en behandeling. Neutronentechnieken zouden details kunnen verschaffen over de actieve plaats:waterstofbinding, waterorganisatie, ligandbinding - dat zou helpen bij het ontwerpen van verbeterde kankermedicijnen.

Wildtype HCA II, HCA IX Mimic (waarbij een deel van het HCA II-molecuul is aangepast om de actieve plaats van het HCA IX-eiwit na te bootsen) en een HCA IX-oppervlaktevariant (SV), die 6 oppervlaktemutaties heeft om het oplosbaarder en stabieler te maken, waren de eiwitten die voor het project werden gekozen. Wanneer het niet efficiënt is om gedeutereerde eiwitten te maken door ze helemaal opnieuw te maken of ze commercieel te kopen, ze worden gedeutereerd via H-D-uitwisseling waar het wordt "geweekt" in een gedeutereerde oplossing (buffer). Voor dit werk werden ze allemaal tot expressie gebracht in E.coli onder gehydrogeneerde en gedeutereerde omstandigheden om H- en D-versies te maken.

Vervolgens gingen ze de eiwitten kristalliseren met behulp van dampdiffusiemethoden, zodat de kristallen konden worden bestudeerd met behulp van zowel röntgen- als neutronenkristallografie.

Dit was geen gemakkelijke taak. Eiwitten zijn erg gevoelig. Het was noodzakelijk om opstellingen te gebruiken die stabiel zijn voor lange incubatie- en evenwichtsperioden. De temperatuur, verdampingssnelheden, pH en eiwit- en neerslagmiddelconcentraties moesten allemaal zorgvuldig worden gecontroleerd met behulp van kristallisatieputjes en automatische controle, bijvoorbeeld door de temperatuur naar wens op en neer te laten gaan.

Aanvullend, om kristallen te maken die groot genoeg zijn voor neutronenkristallografie, u moet een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal gebruiken, typisch 100-500 microliter of 100s mg. Deze grote volumes betekenen dat de kristalgroei traag is - dus de omstandigheden moesten gedurende vele maanden achtereen worden gecontroleerd.

Helaas, de verkregen kristalopbrengsten voor de gedeutereerde versies waren niet zo goed als voor de waterstofversies, regelmatig minder en kleinere kristallen produceren. Er werd ontdekt dat je voor sommige gedeutereerde eiwitten helemaal geen gebruik kon maken van de omstandigheden die werkten voor de waterstofversies en dat de omstandigheden verder moesten worden geoptimaliseerd om gedeutereerde kristallen te laten groeien.

Maar met doorzettingsvermogen, Zoë en Katarina zijn erin geslaagd om een ​​HCA (IX) SV-kristal van meer dan 1 mm3 en een 1,8 mm3-kristal van HCA (IX)-imitatie te kweken. Ze hebben nu röntgenresultaten en ook neutronenresultaten kunnen verkrijgen van LADI bij ILL en iBIX in Japan.