Een beeldvormingstechniek met één molecuul, eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering (PIFE) genoemd, heeft de afgelopen jaren aan populariteit gewonnen als een populair hulpmiddel voor het observeren van DNA-eiwit-interacties met nanometerprecisie. Nog, volgens een nieuwe KAUST-studie, onderzoekslaboratoria hebben de techniek niet optimaal benut.

De PIFE-test is gebaseerd op het idee dat DNA dat is gelabeld met een fluorescerende kleurstof helderder zal gloeien wanneer eiwitten in de buurt worden gebonden. In veel gevallen, dit is waar - wat ertoe heeft geleid dat veel wetenschappers PIFE hebben aangenomen boven andere, meer arbeidsintensieve technieken die afhankelijk zijn van dubbele etikettering van eiwitten en DNA.

Maar de afgestudeerde studenten van Samir Hamdan, Fahad Rashid, Manal Zaher en Vlad-Stefan Raducanu realiseerden zich dat eiwitbinding aan DNA-kleurstofcomplexen soms ook het tegenovergestelde effect kan hebben. In plaats van het fluorescerende signaal te versterken, eiwitinteracties kunnen soms de gloed dempen, afhankelijk van bepaalde eigenschappen van het systeem.

Hamdan dankt de nieuwsgierigheid van zijn studenten voor het maken van deze observatie en het gedetailleerd beschrijven van hoe het werkt. Inspiratie uit het eerdere werk van Rashid leidde het team naar het fenomeen dat ze eiwit-geïnduceerde fluorescentie quenching (PIFQ) noemen. En zoals Rashid uitlegt, "We wilden de omstandigheden die leiden tot fluorescerende booms of busts beter definiëren."

Door een combinatie van experimentele en computationele analyses, het KAUST-team toonde aan dat de initiële fluorescentietoestand van het DNA-kleurstofcomplex bepaalt of PIFE of PIFQ zal resulteren na eiwitbinding. Zonder deze kennis, de waarschijnlijkheid van een van beide gebeurtenissen wordt gelijk aan een toss, die de mechanistische interpretatie van laboratoriumresultaten in gevaar kunnen brengen.

"Wanneer inzicht in deze begintoestand wordt verkregen uit fluorescentie en structureel werk, het anticiperen op een van beide effecten wordt experimenteel mogelijk, " legt Raducanu uit.

Factoren zoals DNA-sequentie en kleurstofpositie zouden de balans kunnen doen doorslaan in de richting van PIFE of PIFQ; het KAUST-team werd zo goed in het interpreteren van de moleculaire code dat ze nauwkeurig konden voorspellen wat er zou gebeuren door simpelweg te meten hoe deze parameters de initiële fluorescentietoestand van het DNA-kleurstofsysteem beïnvloeden.

"We hebben van elke meting een spel gemaakt, "Zahr zegt, "en we zijn blij te kunnen zeggen dat onze hypothese de uitkomst meer dan 90 procent van de tijd voorspelde!"

Deze nieuwe inzichten zouden het bereik en de experimentele belofte van deze krachtige beeldvormingstool met één molecuul drastisch moeten vergroten, voorspelt Raducanu. "Door PIFQ te introduceren, we bieden onderzoekers in het veld de mogelijkheid om verschillende biologische vragen aan te pakken waar PIFE mogelijk niet getuige van was, " hij zegt.

Wetenschappers kunnen er ook voor kiezen om PIFE en PIFQ te combineren om meerstaps- en multi-eiwitprocessen te ontcijferen met slechts een enkel DNA-kleurstofconstruct.

"Rekening houdend met de contextafhankelijke aard van fluorescentiemodulatie in het DNA-kleurstofsysteem opent de deur naar vele mogelijkheden in experimenteel ontwerp die kunnen worden aangepast aan de behoeften van onderzoekers, "zegt Zaher.

"We verwachten nu dat de interpretatie van gegevens en toewijzing van moleculaire gebeurtenissen uit gegevens van één molecuul gemakkelijker en nauwkeuriger zal worden, ' voegt Rashid toe.