Een van de belangrijkste uitdagingen bij de productie van biobrandstoffen van de tweede generatie is het identificeren van enzymen die door micro-organismen worden geproduceerd voor gebruik in een cocktail van enzymen om de hydrolyse van biomassa te katalyseren, waarbij de enzymen samenwerken om de koolhydraten in suikerrietafval en bagasse af te breken, bijvoorbeeld, en zet ze om in eenvoudige suikers voor fermentatie.

Een groep onderzoekers van de Universiteit van Campinas (UNICAMP), in samenwerking met collega's van het Braziliaanse Biorenewables National Laboratory (LNBR) in Campinas, staat São Paulo, Brazilië, heb ontdekt dat Trichoderma harzianum , een schimmel gevonden in de Amazone, produceert een enzym dat een sleutelrol kan spelen in enzymcocktails.

Het enzym, die β-glucosidase wordt genoemd en behoort tot de glycosidehydrolasefamilie 1 (GH1), werkt in de laatste fase van de afbraak van biomassa om vrije glucose te produceren voor fermentatie en omzetting in ethanol. In het laboratorium, echter, de onderzoekers zagen dat hoge glucosespiegels de activiteit van β-glucosidase remden.

"We ontdekten ook dat de optimale katalytische activiteit van het enzym plaatsvond bij 40 ° C. Dit vormde een ander obstakel voor het gebruik van het enzym omdat in een industriële omgeving, de enzymatische hydrolyse van biomassa wordt uitgevoerd bij hogere temperaturen, typisch rond de 50 °C, " zei Clelton Aparecido dos Santos, een postdoctoraal onderzoeker bij UNICAMP's Centre for Molecular Biology and Genetic Engineering (CBMEG) met een beurs van FAPESP.

Gebaseerd op een analyse van de structuur van het enzym in combinatie met genomica en moleculair biologische technieken, de onderzoekers waren in staat om de structuur aan te passen om deze problemen op te lossen en de efficiëntie van de afbraak van biomassa aanzienlijk te verbeteren.

Het onderzoek was het resultaat van een project met een reguliere onderzoeksbeurs van FAPESP en een thematisch project dat ook door FAPESP wordt ondersteund. De bevindingen zijn gepubliceerd in het tijdschrift Wetenschappelijke rapporten .

"Het gemodificeerde eiwit dat we ontwikkelden, bleek veel efficiënter dan het ongemodificeerde enzym en kan worden gebruikt als aanvulling op de enzymcocktails die tegenwoordig worden verkocht om biomassa af te breken en biobrandstoffen van de tweede generatie te produceren. ', vertelde Santos.

Om tot het gemodificeerde eiwit te komen, de onderzoekers vergeleken aanvankelijk de kristalstructuur van het oorspronkelijke molecuul met structuren van andere wildtype β-glucosidasen in de GH1- en GH3-glycosidehydrolase-families. De resultaten van de analyse toonden aan dat glucosetolerante GH1-glucosidasen een dieper en smaller substraatkanaal hadden dan andere β-glucosidasen en dat dit kanaal de glucosetoegang tot de actieve plaats van het enzym beperkte.

Minder glucosetolerante β-glucosidasen hadden een ondieper maar breder ingangskanaal van de actieve site, waardoor meer van de glucose die door deze enzymen wordt geproduceerd, de laatste fase van de afbraak van de biomassa kan binnengaan. Vastgehouden glucose blokkeert het kanaal van het eiwit en vermindert de katalytische activiteit ervan.

Op basis van deze observatie, de onderzoekers gebruikten een moleculair-biologische techniek die bekend staat als plaatsgerichte mutagenese om twee aminozuren te vervangen die zouden kunnen fungeren als "poortwachters" bij de ingang van de actieve plaats van het enzym, glucose binnenlaten of blokkeren. Analyse van hun experimenten toonde aan dat de wijziging het kanaal naar de actieve site vernauwde.

"De actieve plaats van het mutante enzym kromp tot een vergelijkbare grootte als die van de glucosetolerante GH1 β-glucosidasen, ' zei Santos.

Verbeterde efficiëntie

De onderzoekers voerden een aantal experimenten uit om de prestaties van het verbeterde eiwit bij het afbreken van biomassa te meten, vooral suikerriet bagasse, een agro-industrieel afval met een enorm potentieel voor winstgevend gebruik in Brazilië. Tijdens een onderzoeksstage in het buitenland met een beurs van São Paulo Research Foundation—FAPESP, Santos werkte samen met een onderzoeksgroep onder leiding van Paul Dupree, een professor aan de Universiteit van Cambridge in het VK, op een analyse van de glucose-afgifte-efficiëntie van het op maat gemaakte enzym wanneer verschillende bronnen van plantaardige biomassa werden omgezet.

De analyse toonde aan dat de katalytische efficiëntie van het gemodificeerde enzym 300% hoger was dan die van het wildtype enzym in termen van glucoseafgifte. Bovendien, het was meer glucosetolerant, dus er kwam meer glucose vrij uit alle geteste plantaardige biomassagrondstoffen. De mutatie verbeterde ook de thermische stabiliteit van het enzym tijdens de fermentatie.

"Mutatie van de twee aminozuren op de actieve plaats maakte het enzym superefficiënt. Het is klaar voor industriële toepassing, " zei Anete Pereira de Souza, een professor bij UNICAMP en hoofdonderzoeker van het project. "Een van de voordelen van het enzym is dat het in vitro wordt geproduceerd en niet door een gemodificeerde schimmel of ander organisme, zodat het tegen relatief lage kosten in massa kan worden geproduceerd."