science >> Wetenschap >  >> Chemie

Nieuwe fluorescerende kleurstoffen kunnen biologische beeldvorming bevorderen

Nieuwe rhodaminekleurstoffen gesynthetiseerd in het Lavis Lab. Krediet:Jonathan B. Grimm

Met een nieuwe techniek om een ​​spectrum van gloeiende kleurstoffen te maken, scheikundigen jagen niet langer op regenbogen.

Het verwisselen van specifieke chemische bouwstenen in fluorescerende moleculen, rhodamines genaamd, kan bijna elke kleur genereren die wetenschappers wensen - ROYGBIV en daarbuiten, onderzoekers rapporteren 4 september 2017 in het journaal Natuurmethoden .

Het werk biedt wetenschappers een manier om de eigenschappen van bestaande kleurstoffen doelbewust aan te passen, ze moediger maken, helderder, en ook meer celdoorlatend. Zo'n uitgebreid palet van kleurstoffen zou onderzoekers kunnen helpen de interne werking van cellen beter te verlichten, zegt studieleider Luke Lavis, een groepsleider op de Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute in Ashburn, Virginia. Zijn team verlichtte celkernen, larvale fruitvlieghersenen laten glanzen, en benadrukte visuele cortex-neuronen bij muizen met kleine glazen ramen in hun schedels.

Vroeger bedachten wetenschappers verschillende kleurstoffen, meestal met vallen en opstaan, zegt Lavis. "Nutsvoorzieningen, we hebben de regels bedacht, en we kunnen bijna elke kleur maken." De methode van zijn team zou scheikundigen in staat kunnen stellen honderden verschillende kleuren te synthetiseren.

Een heldere geschiedenis

Tot ongeveer 20 jaar geleden, wetenschappers vertrouwden op chemische fluorescerende kleurstoffen om biologische moleculen zichtbaar te maken. Om in cellen te gluren, het kleuren van organellen, en andere beeldvormende experimenten, "chemie was koning, " Lavis schreef in een 13 juli, 2017 perspectief in het tijdschrift Biochemie . En dan, de koning werd van de troon geschopt - door een gloeiend groen kwalleneiwit genaamd GFP.

1994, wetenschappers rapporteerden het gebruik van een genetische truc om GFP te tackelen, het groene fluorescerende eiwit, op andere cellulaire eiwitten; het is alsof je de eiwitten dwingt om een ​​glowstick vast te houden. Die truc gaf onderzoekers een eenvoudigere manier om de bewegingen van eiwitten onder een microscoop te volgen - zonder dure synthetische kleurstoffen te gebruiken. De innovatie raasde door het veld van biologische beeldvorming. In 2007, Door GFP en twee andere fluorescerende eiwitten door wetenschappers te mengen, konden ze muisneuronen een parade van levendige kleuren schilderen in een techniek die bekend staat als de 'Brainbow'. Een jaar later, de ontdekking en ontwikkeling van GFP leverde de Nobelprijs voor scheikunde op voor drie wetenschappers, waaronder wijlen Roger Tsien, een HHMI-onderzoeker.

Zuivering van een nieuw Janelia Fluor 549-derivaat met behulp van flashchromatografie. Krediet:Luke D. Lavis

Maar GFP heeft ook enkele duistere kanten. Het is een relatief onhandig molecuul dat is opgebouwd uit de beperkte set natuurlijke aminozuren. Dus GFP is niet altijd helder genoeg om te onthullen wat wetenschappers proberen te zien.

Dus keerden de onderzoekers terug naar de chemie. Wetenschappers hadden geavanceerde microscopen en nieuwe technieken ontwikkeld om celinhoud te labelen, Lavis zegt, maar de kleurstoffen voor het markeren van moleculen in cellen zaten nog vast in de negentiende eeuw. Zijn team richtte zich op rhodamines, omdat ze bijzonder helder en celdoorlatend zijn - zodat ze gemakkelijk in cellen glijden en ze laten gloeien. Maar ondanks het feit dat we al meer dan 100 jaar met rhodamines werken, scheikundigen hadden slechts enkele tientallen kleuren gemaakt, en de meeste waren vergelijkbare tinten, variërend van groen tot oranje.

Tot voor kort, het maken van nieuwe rhodamines was niet eenvoudig. Wetenschappers gebruikten nog steeds technieken uit de vroegste dagen van de chemie, kokende chemische ingrediënten in zwavelzuur. Dit dwingt de moleculen om met elkaar te verbinden in wat een condensatiereactie wordt genoemd. Het mengen van verschillende bouwstenen kan nieuwe en ongebruikelijke kleurstoffen opleveren. Maar ingrediënten moesten sterk genoeg zijn om het kokende zuurbad te overleven - wat niet veel opties overliet.

Laat het gloeien

In 2011, Het team van Lavis ontwikkelde een nieuwe manier om te sleutelen aan de structuur van rhodamines, onder mildere omstandigheden. Met behulp van een reactie veroorzaakt door het metaal palladium, de onderzoekers konden de zuurstap overslaan en kleurstoffen construeren met ingewikkelder bouwstenen dan eerder was gebruikt.

Deze vriendelijkere, zachtere aanpak opende de deur naar een wijde nieuwe wereld van kleurstoffen, en het team van Lavis doken erin. Vier jaar later, ze onthulden de Janelia Fluor-kleurstoffen, fluorescerende moleculen tot 50 keer helderder dan andere kleurstoffen, en ook stabieler. Het geheim achter de Janelia Fluor-kleurstoffen is een klein vierkant aanhangsel dat een azetidine-ring wordt genoemd - een structuur die alleen mogelijk wordt gemaakt door de nieuwe chemische benadering van Lavis.

Wetenschappers kunnen verschillende strategieën gebruiken om de heldere kleurstofmoleculen op het eiwit te krijgen dat ze willen bestuderen. Vervolgens, ze kunnen inzoomen op het verlichte eiwit, en kijk hoe het ronddraait en interageert met andere moleculen - zonder de gebruikelijke wazigheid op de achtergrond.

Nieuwe rhodaminekleurstoffen gesynthetiseerd in het Lavis Lab fluorescerend onder UV-verlichting. Krediet:Jonathan B. Grimm

"Voor ons, het was een totale revolutie op het gebied van beeldvorming met één molecuul, " zegt moleculair bioloog Xavier Darzacq van de Universiteit van Californië, Berkeley. Voordat u de Janelia Fluor-kleurstoffen gebruikt, de fluorescerende transcriptiefactor-eiwitten die zijn team bestudeerde, waren te zwak om in scherpe beelden vast te leggen. Onderzoekers moesten de sluiter van de camera 10 milliseconden openhouden om voldoende licht te verzamelen. Dat is lang genoeg voor eiwitten om rond te dwalen, dus het beeld zou wazig worden - zoals een foto van een kronkelige peuter. Maar de Janelia-kleurstoffen zijn helder genoeg dat zijn team in slechts een milliseconde moleculen in actie kan vangen. zegt Darzacq. Dankzij zulke snelle snapshots kon zijn team laboratoriumexperimenten doen die hij beschrijft als 'een paar jaar geleden gewoon ondenkbaar'.

Nutsvoorzieningen, Lavis' groep heeft ontdekt hoe ze hun fluorescerende kleurstoffen kunnen verfijnen, door de structuur van rhodamines nog verder aan te passen. Rhodamines hebben een basisontwerp met vier ringen met groepen atomen die uit verschillende delen van de ringen steken. In eerder werk, de wetenschappers ontwikkelden strategieën voor grove kleurstoffen - knip hier een heel aanhangsel uit, en je kunt een groene kleurstof maken. Stop daar een siliciumatoom in, en je hebt rood. Lavis ontdekte dat door voorzichtig een paar nieuwe atomen in de kleurstofstructuur te plaatsen, de kleur en chemische eigenschappen van de kleurstoffen kunnen ook worden verfijnd, waardoor vele tinten groen mogelijk zijn vanaf één enkele steiger. Het is alsof je van het klassieke 8-pack kleurpotloden naar de jumbo-doos van 64 gaat.

In een apart blad, gepubliceerd op 9 augustus 2017 in het journaal ACS Centrale Wetenschap , het team beschreef een manier om de onderste ring van de kleurstofstructuur te wijzigen.

"Het belangrijkste is dat het allemaal modulair en rationeel is, " zegt Lavis. Selecteer de juiste atomen, hij legt uit, en chemici kunnen kleurstoffen maken met bijna elke eigenschap die ze willen.

Zijn groep ent verschillende chemicaliën op rhodamines, en analyseerde vervolgens de eigenschappen van de nieuwe kleurstoffen. "Niemand had ooit eerder op zo'n systematische manier naar rhodamines gekeken, ", zegt hoofdauteur Jonathan Grimm, een senior wetenschapper bij Janelia.

De kleurstoffen worden in één stap gesynthetiseerd met goedkope ingrediënten, zegt Lavis. Dat maakt de kleurstoffen goedkoper dan commerciële alternatieven - centen per injectieflacon. Door de lage kosten kon zijn team hun werk delen met wetenschappers over de hele wereld. Lavís, Grimm, en collega's hebben nu duizenden flacons naar honderden verschillende laboratoria verzonden.

"Deze kleurstoffen zijn een complete game-changer, " zegt Ethan Garner, een bacteriële celbioloog aan de Harvard University die ze heeft gebruikt om het pad van afzonderlijke moleculen in zijn laboratorium te traceren. Het enige nadeel was dat wetenschappers niet veel verschillende kleuren hadden om uit te kiezen. Maar nu, hij zegt, met het werk van Lavis, "Ze kunnen eigenlijk het hele spectrale bereik bestrijken."