Een nieuwe methode om de high-yield te verbeteren, hoge zuiverheid, hoge-activiteitszuivering van complexe eiwitten met een factor 10 tot 500 is ontwikkeld aan de Universiteit van Alabama in Birmingham.

"Deze nieuwe methode biedt een aantal cruciale voordelen voor zowel onderzoekers als de farmaceutische industrie, " zei Dmitry Vassylyev, hoogleraar biochemie en moleculaire genetica aan de UAB. "Het is potentieel het meest efficiënte en universele hulpmiddel voor high-throughput-onderzoeken van veel belangrijke biologische systemen en kan de grootschalige productie van therapeutische eiwitten helpen."

Hoge opbrengst, hoge zuiverheid, hoogactieve zuivering, of HHH, is de heilige graal voor structurele en industriële toepassingen. Het UAB eenstaps zuiveringsschema overwint significante zwakheden van de huidige commercieel verkrijgbare zuiveringssystemen, zegt Vassylyev.

In een paper gepubliceerd in Proceedings van de National Academy of Sciences , Vassylyev en UAB-collega's testten hun CL7/Im7-affiniteitschromatografiezuiveringsmethode op vijf traditioneel uitdagende biologische moleculen, waaronder prokaryotische en eukaryote membraaneiwitten en multisubeenheid DNA/RNA-bindende eiwitten.

"Een opmerkelijke illustratie van de superieure prestaties van de CL7/Im7-aanpak, schreven ze in het PNAS-rapport, "is dat het CNX-eiwitmonster, die we in een paar uur hebben gezuiverd en van slechts een paar gram E. coli-cellen, zou een marktwaarde hebben van ongeveer $ 400, 000, volgens de huidige commerciële prijzen."

Het systeem is eenvoudig en herbruikbaar:de UAB-onderzoekers hebben hun affiniteitschromatografiekolom meer dan 100 keer gerestaureerd en opnieuw gebruikt, behoud van bijna 100 procent bindingscapaciteit.

De methode is gebaseerd op de opmerkelijk sterke bindingsaffiniteit tussen bacteriële toxines, colicinen genaamd, en hun specifieke immuniteitseiwitten. Een gastheerbacterie kan een colicinetoxine afgeven, zoals Colicin E7 DNAse, dat andere bacteriën kan doden. Binnen de gastheerbacteriën, de CE7 is gebonden aan Immunity Protein 7, of Im7; deze binding voorkomt zelfvernietiging.

De bindingsaffiniteit van CE7/Im7 is bijna net zo sterk als een covalente binding, en het is vier tot zeven ordes van grootte hoger dan bij andere affiniteitschromatografie-analogen. Vassylyev en collega's maakten een inactieve variant van CE7, genaamd CL7, die geen DNase-activiteit heeft maar volledige bindingsaffiniteit voor Im7 behoudt. Ze maakten ook een variant van Im7 die een efficiënte koppeling aan agaroseparels mogelijk maakt.

Met behulp van genetische technieken, de CL7-tag is gemakkelijk in te brengen in genen van doeleiwitten, in zowel eukaryoten als prokaryoten. Deze genen kunnen worden verplaatst naar een expressievector, of het gelabelde doeleiwit kan zonder amplificatie uit natieve cellen tot expressie worden gebracht.

Wanneer een ruw eiwitlysaat door een kolom wordt gegoten die gevuld is met de Im7-agaroseparels, de CL7-tags op het doeleiwit binden aan de Im7. Een gemanipuleerde proteaseplaats wordt gebruikt om het doeleiwit vrij te maken van de gebonden CL7-tag. Dit maakt eenstaps HHH-zuivering mogelijk, met 97 tot 100 procent zuiverheid, voor de doeleiwitten die zijn getest door de UAB-onderzoekers.

In tegenstelling tot, de meeste gepubliceerde zuiveringsschema's voor deze uitdagende eiwitten zijn meerstaps, meerdaagse protocollen, met lagere opbrengsten. Vassylyev, een eiwitkristallograaf, zegt dat het verkrijgen van grote hoeveelheden puur eiwit de snelheidsbeperkende stap is in kristallografie, hem ertoe aanzetten om vier jaar geleden op zoek te gaan naar een betere methode.

De uitdagende eiwitten die in het PNAS-rapport werden gezuiverd, waren bacteriële Thermus thermophilus RNA-polymerase en Mycobacteria tuberculosis RNA-polymerase, die multisubeenheid-eiwitten zijn; YidC-membraanintegrase, een Bacillus halodurans membraaneiwit; calnexine, of CNX, een humaan transmembraan chaperonne-eiwit; en twee nucleïnezuurbindende eiwitten, het multisubunit condensine-eiwitcomplex van Salmonella typhimurium dat cellulair DNA vouwt en comprimeert, en het menselijke hermodellering- en afstandsfactorcomplex, RSF, die betrokken is bij het mediëren van nucleosoomassemblage.

Het eenvoudige zuiveringssysteem is ook toepasbaar op pulldown-experimenten en kinetische activiteit of bindingsassays, zoals oppervlakteplasmonresonantie. Het kan ook helpen bij cryo-elektronenmicroscopie.