Integrale membraaneiwitten, of IMP's, zijn een belangrijke klasse van eiwitten die een cruciale rol spelen in veel cellulaire processen, inclusief de katalyse van disulfidebindingen, die essentieel zijn voor de functie en stabiliteit van veel eiwitten zoals antilichamen, die een aanzienlijk therapeutisch potentieel hebben.

Maar IMP's zijn intrinsiek hydrofoob en hebben dus een lage oplosbaarheid in waterige omgevingen. Hun natuurlijke omgeving bevindt zich binnen het lipide dubbellaagse membraan van een cel, wat het moeilijk maakt om hun structuur en functie te bestuderen.

Een eerder gerapporteerde methode met behulp van standaard recombinant-DNA-technieken en enkele nieuwe ontwerpprincipes stelde een team van chemische ingenieurs van Cornell in staat om eenvoudig en goedkoop grote hoeveelheden functionele IMP's te maken - allemaal zonder het gebruik van agressieve chemicaliën of detergenten, die tegenwoordig typisch worden gebruikt. dat elftal, onder leiding van Matt DeLisa, de William L. Lewis Professor of Engineering aan de Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, heeft nu die eiwit-engineeringmethode gebruikt om een ​​membraangebonden enzym om te zetten in een in water oplosbare biokatalysator die direct in de waterige binnencel functioneert.

"Je kunt deze lastige eiwitten opnieuw ontwerpen, waardoor ze in water oplosbaar zijn, en misschien heel verrassend, ze kunnen doorgaan met het katalyseren van hun natuurlijke biologische reacties, " zei DeLisa, hoofdonderzoeker voor "Een in water oplosbare DsbB-variant die de vorming van disulfidebindingen in vivo katalyseert, " gepubliceerd 19 juni in Natuur Chemische Biologie .

"Voor zover we weten, dit is het eerste voorbeeld van het creëren van een in water oplosbare IMP die zijn natuurlijke katalytische activiteit behoudt, maar dat doet in een geheel nieuwe cellulaire omgeving, "Zei DeLisa. "En omdat het een genetisch gemanipuleerde constructie is, het kan tot expressie worden gebracht zoals elk ander oplosbaar eiwit met heel weinig moeite of moeite."

Eerste auteur is Dario Mizrachi, voormalig postdoctoraal medewerker in chemische en biomoleculaire technologie die nu een assistent-professor is aan de Brigham Young University. Medewerkers waren onder meer Michael-Paul Robinson, doctoraatsstudent in chemische en biomoleculaire engineering, en Mehmet Berkmen van New England Biolabs.

In het eerdere werk van de groep werd een methode beschreven die ze SIMPLEx noemden (Solubilization of Integral Membrane Proteins with High Levels of Expression), voor het afschermen van IMP's tegen water en het mogelijk maken van de productie van grote hoeveelheden van deze moeilijk te maken eiwitten. Met behulp van recombinant-DNA-technieken, ze hechtten een kunstmatig membraaneiwit aan elkaar met een identiteitscrisis - een die zijn biologische functie behoudt, maar denkt dat het oplosbaar is in water.

Dit laatste werk is de eerste toepassing van die techniek. De groep gebruikte hun identiteit-geschakelde IMP's om disulfidebindingen te maken, een soort post-translationele modificatie die in veel eiwitten voorkomt en bijna alle aspecten van de normale celbiologie en pathogenese beïnvloedt.

De groep richtte zich op het bacteriële integrale membraanenzym DsbB, een centrale biokatalysator bij de vorming van disulfidebindingen, hoewel DeLisa gelooft dat de techniek overdraagbaar is naar talloze andere membraaneiwitten.

Met behulp van de SIMPLEx-methode, de groep zette membraangebonden DsbB om in een in water oplosbare biokatalysator die gemakkelijk tot expressie kon worden gebracht in het E. coli-cytoplasma, waar het leidde tot de vorming van disulfidebindingen in een reeks eiwitdoelen.

Disulfidebindingen zijn belangrijke spelers in veel therapeutische eiwitten, zoals monoklonale antilichamen. Veel kankermedicijnen gebruiken deze moleculen, die de aanval van het immuunsysteem op tumorcellen kunnen nabootsen of versterken.

Het vermogen om de katalysator uit het lipidemembraan te halen en in het cytoplasma te plaatsen, DeLisa zei, stelt wetenschappers in staat om deze antilichamen op mogelijk gunstiger locaties in de cel te maken.

"We zouden deze route in het cytoplasma kunnen maken ... [of] we kunnen alles naar een ander subcellulair compartiment zoals het periplasma verplaatsen, of mogelijk het hele pad uit de cel halen en het opnieuw samenstellen in een celvrij systeem, " zei DeLisa. "Het punt is, we creëren een enorme hoeveelheid flexibiliteit in termen van het maken van deze bindingen door in wezen een membraaneiwit in een oplosbaar enzym te veranderen."