Wetenschappers hebben Diamond Light Source gebruikt om een ​​nieuwe methode te ontwikkelen om voorheen verborgen informatie te extraheren uit de röntgendiffractiegegevens die worden gemeten bij het oplossen van de driedimensionale (3D) atomaire structuren van eiwitten en andere biologische moleculen.

Bij het proberen om chemische verbindingen te evolueren naar krachtige kandidaat-geneesmiddelen, wetenschappers proberen het atomaire detail te bestuderen van hoe verbindingen binden aan hun doeleiwitten. Om dit te doen, ze vergelijken röntgengegevens gemeten in zowel aanwezigheid als afwezigheid van de verbinding. Echter, met bestaande analyse-algoritmen, dit verschilsignaal kan vaak worden overspoeld door ruis van experimentele artefacten, waardoor het zeer onbetrouwbaar is om het waargenomen signaal te interpreteren.

De nieuwe Pan-Dataset Density Analysis (PanDDA)-methode extraheert het beeld van de gebonden verbinding in uitzonderlijk helder en ondubbelzinnig detail. PanDDA identificeert eerst de bron van de ruis, en verwijdert het vervolgens uit de gegevens. Het maakt gebruik van het vermogen van Diamond om tientallen tot honderden metingen snel te herhalen, die vervolgens worden gekenmerkt voor verschillen tussen hen, wat wijst op de aanwezigheid van gebonden verbinding, waarna in 3D een ruiscorrectie wordt toegepast. De resultaten worden vandaag gepubliceerd in Natuurcommunicatie .

Macromoleculaire kristallografie (MX), de techniek die PanDDA toepast, is een van de krachtigste hulpmiddelen die worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bepalen van de 3D-structuren van grote biologische moleculen, inclusief eiwitten, en is het werkpaardexperiment voor rationeel medicijnontwerp.

"Het probleem van het identificeren van bindingsgebeurtenissen in kristallografische datasets kan aanvoelen als zoeken naar een speld in een hooiberg, " legt Dr Nicholas Pearce uit, hoofdauteur van het artikel dat afkomstig is van zijn PhD-project aan de Universiteit van Oxford in het Systems Approaches for Biomedical Science (SABS) Centre for Doctoral Training, waar hij gezamenlijk werd gefinancierd door UCB Pharma en Diamond. "In het geval van de gegevens die we analyseerden, het was nog erger, omdat we honderden hooibergen hadden, en wist niet in welke naalden zaten." Nick is nu verbonden aan de Crystal &Structural Chemistry Group van de Universiteit Utrecht.

De onderzoekers konden in hun voordeel profiteren van het feit dat de meeste metingen afkomstig waren van 'lege' kristallen die geen gebonden ligand bevatten, waardoor ze de ongebonden vorm konden karakteriseren en eenvoudig naar datasets konden zoeken die anders waren.

"Vaak kun je in kristallografie 'zwakke' gebonden vormen missen, omdat elke meting een superpositie is van de gebonden en ongebonden vormen, " vervolgt Dr. Pearce. "Dit is vergelijkbaar met meerdere vellen overtrekpapier, elk met een van ten minste twee afbeeldingen, allemaal over elkaar heen gelegd."

"Als je probeert de afbeelding op slechts één van de 'vellen' te identificeren, het raakt in de war door wat er door alle andere bladen heen komt, zodat het beeld vatbaar wordt voor interpretatiefouten, " Dr. Pearce voegt toe. "Om dit te overwinnen, we hebben een methode ontwikkeld om de juiste set 'sheets' uit de superpositie te halen; toen we dat eenmaal hadden gedaan, het interpreteren van de gebonden vorm wordt veel gemakkelijker, en stelt ons in staat om de gegevens met vertrouwen te interpreteren, en modellen bouwen van de interessante toestanden in de gegevens."

"Het basisidee is conceptueel heel eenvoudig, namelijk de verwarrende superpositie behandelen als een achtergrondcorrectieprobleem, " legt professor Frank von Delft uit, die gezamenlijk hoofdonderzoeker is van de Protein Crystallography-groep in het Structural Genomics Consortium (SGC) aan de Universiteit van Oxford, en Principal Beamline Scientist van de I04-1 beamline bij Diamond. "Echter, een nauwkeurige schatting van de achtergrond is cruciaal, en in de praktijk was dit ondenkbaar tot de komst van de nieuwe robottechnologie aangeboden door Diamond, waardoor het routine is om zulke grote aantallen metingen te doen."

"UCB is verheugd om nauw samen te werken met Diamond bij de ontwikkeling van PanDDA en de toepassing ervan op kristallografische fragmentscreening, " zegt Dr. Neil Weir, Senior Vice President of Discovery bij UCB Pharma. "Als direct gevolg we hebben fragmenten kunnen identificeren, die anders niet van de achtergrond te onderscheiden waren, gebonden aan een belangrijk doelwit voor eiwit-eiwitinteracties."

Het onderzoek omvatte het produceren van ongeveer 860 datasets, waarvan er slechts 75 een gebonden vorm bevatten die voor de onderzoekers interessant is. "Hoewel algemeen van toepassing in MX, de methode is bijzonder transformatief voor een versie van het MX-experiment dat fragmentenscreening wordt genoemd, waar de effecten die we zoeken zeer zeldzaam zijn en nog moeilijker te verifiëren met conventionele algoritmen, ’ vervolgt von Delft.

Een cruciaal onderdeel van het werk was het uploaden van alle structuren naar de Protein Data Bank (wwPDB), de online opslagplaats van 3D-structuren van eiwitten en nucleïnezuren, waar iedereen volledig vrije toegang heeft tot alle ooit gepubliceerde structuren. Een van de wwPDB-hostsites, RCSB VOB, heeft onlangs een nieuwe groepsdepositietool ontwikkeld om de massale upload van constructies mogelijk te maken, en dit was cruciaal om deze samenwerking te voltooien.

Met het RCSB PDB Group Deposition-systeem kunnen auteurs profiteren van lokale sjablonen en PDB_extract voor batchverwerking, inpakken, uploaden, beoordeling, geldigmaking, en één-klik indiening van vele structuren tegelijk. Zoeken in de groepstitel "PanDDA analysis group deposition" op rcsb.org levert deze 860 deposities op.

"De Diamond- en PDB-groepen hebben iets ongelooflijks bereikt, en we hebben ze met veel plezier geholpen", zegt Aled Edwards, Directeur van de SGC. "I would also like to highlight the team's commitment to open science. By placing all the research output into the public domain, they have ensured that the data can be used by all."

Now celebrating its 10th year of research and innovation, Diamond is committed to working with our users to enable them to carry out world-leading research at the facility.

"We've come a long way in the last ten years, and collaborations like these are key to how we will maintain our place as a key facility for researchers working in the life sciences, " adds Professor Dave Stuart, Director of Life Sciences at Diamond. "The idea that we can clearly see weak binding events is particularly exciting and something we're looking forward to sharing with our crystallography community."

The researchers hope that this new method will provide a significant shift in how crystallographic models are generated; opening windows to explore more poorly ordered crystals.