Synthetische biologen van Rice University hebben bacteriële detectie gehackt met een plug-and-play-systeem dat kan worden gebruikt om tienduizenden sensorische inputs en genetische outputs te mixen en matchen. De technologie heeft verstrekkende gevolgen voor de medische diagnostiek, de studie van dodelijke ziekteverwekkers, milieumonitoring en meer.

In een project van bijna zes jaar, Rice bio-ingenieur Jeff Tabor en collega's voerden duizenden experimenten uit om aan te tonen dat ze systematisch tweecomponentensystemen konden herbedraden. de genetische circuits die bacteriën gebruiken om hun omgeving waar te nemen en naar hun buren te luisteren. Hun werk verschijnt in een studie die deze week is gepubliceerd in Natuur Chemische Biologie .

De groep van Tabor heeft de uitgangen van bekende bacteriële sensoren opnieuw bedraad en ook sensoren verplaatst tussen verre verwante bacteriën. Het belangrijkste is, ze lieten zien dat ze de functie van een onbekende sensor konden identificeren.

"Op basis van genomische analyses, we weten dat er minstens 25 zijn, 000 tweecomponentensystemen in bacteriën, " zei Tabor, universitair hoofddocent bio-engineering aan Rice's Brown School of Engineering en de hoofdwetenschapper van het project. "Echter, voor ongeveer 99% van hen, we hebben geen idee wat ze voelen of welke genen ze als reactie activeren."

Het belang van een nieuwe tool die tweecomponentensystemen ontgrendelt, wordt onderstreept door de ontdekking in 2018 van twee soorten dodelijke, multiresistente bacterie die een onbekend tweecomponentensysteem gebruikt om colistine te ontwijken, een antibioticum als laatste redmiddel. Maar Tabor zei dat de mogelijke toepassingen van de tool verder gaan dan de geneeskunde.

"Dit is de grootste schat aan biosensoren van de natuur, " zei hij. "Op basis van de voortreffelijke specificiteit en gevoeligheid van enkele van de tweecomponentensystemen die we begrijpen, er wordt algemeen aangenomen dat bacteriële sensoren beter zullen presteren dan alles wat mensen kunnen maken met de beste technologie van vandaag."

Tabor zei dat dit komt omdat bacteriële sensoren zijn aangescherpt en verfijnd door miljarden jaren van evolutie.

"Bacteriën hebben niet zoiets verfijnds als ogen, oren of een neus, maar ze reizen tussen heel verschillende omgevingen - zoals een blad of een darm of de grond - en hun overleving hangt af van hun vermogen om die veranderingen waar te nemen en aan te passen, " hij zei.

"Tweecomponentensystemen zijn hoe ze dat doen, ' zei Tabor. 'Dit zijn de systemen die ze gebruiken om licht te 'zien', "ruik" de chemicaliën om hen heen en "hoor" het laatste gemeenschapsnieuws, die komt in de vorm van biochemische tweets uitgezonden door hun buren."

Bacteriën zijn de meest voorkomende vorm van leven, en tweecomponentensystemen zijn opgedoken in vrijwel elk bacterieel genoom waarvan de sequentie is bepaald. De meeste soorten hebben ongeveer twee dozijn van de sensoren en sommige hebben er enkele honderden.

Er zijn meer dan een half dozijn brede categorieën van tweecomponentensystemen, maar ze werken allemaal op dezelfde manier. Ze hebben een sensor kinase (SK) component die "luistert" naar een signaal van de buitenwereld, en bij het "horen" ervan, initieert een proces dat fosforylering wordt genoemd. Dat activeert de tweede component, een responsregulator (RR) die inwerkt op een specifiek gen - het in- of uitschakelen als een schakelaar of omhoog of omlaag als een knop.

Hoewel de genetische code voor de componenten gemakkelijk te zien is op een genomische scan, het dubbele mysterie maakt het voor biologen bijna onmogelijk om te bepalen wat een tweecomponentensysteem doet.

"Als je het signaal dat het waarneemt niet kent en je weet niet op welk gen het inwerkt, het is heel moeilijk, Tabor zei. "We kennen de input of de output van ongeveer 1% van tweecomponentensystemen, en we kennen zowel de inputs als de outputs voor nog minder."

Wetenschappers weten wel dat SK's typisch transmembraaneiwitten zijn, met een detectiedomein, een soort biochemische antenne, die door het zakachtige buitenmembraan van de bacterie steekt. Elk sensordomein is ontworpen om te vergrendelen op een specifiek signaalmolecuul, of ligand. Elke SK heeft zijn eigen doelligand, en binding met het ligand is wat de kettingreactie start die een gen aanzet, uit, op of neer.

belangrijk, hoewel elk tweecomponentensysteem is geoptimaliseerd voor een specifiek ligand, hun SK- en RR-componenten werken op vergelijkbare manieren. Met dat in gedachten, Tabor en co-hoofdauteur Sebastian Schmidl besloten eind 2013 om te proberen het DNA-bindende domein te verwisselen, het deel van de responsregulator dat DNA herkent en het doelgen van de route activeert.

"Als je kijkt naar eerdere structurele studies, het DNA-bindende domein ziet er vaak uit als vracht die net een lift krijgt van het fosforyleringsdomein, ' zei Tabor. 'Daarom, we dachten dat DNA-bindende domeinen zouden kunnen functioneren als verwisselbare modules, of Legoblokjes."

Om het idee te testen, Schmidl, vervolgens een DFG Postdoctoral Fellow in de groep van Tabor, de componenten opnieuw bedraad van twee lichtsensoren die Tabor's team eerder had ontwikkeld, een die reageerde op rood licht en een andere die reageerde op groen. Schmidl heeft de ingang van de roodlichtsensor opnieuw aangesloten op de uitgang van de groenlichtsensor op 39 verschillende locaties tussen de fosforylerings- en DNA-bindende domeinen. Om te zien of een van de 39 verbindingen werkte, hij stimuleerde ze met rood licht en zocht naar een groen-lichtreactie.

"Tien van hen werkten bij de eerste poging, en er was een optimum, een specifieke locatie waar de splitsing echt goed leek te werken, ' zei Tabor.

In feite, de test werkte zo goed dat hij en Schmidl dachten dat ze misschien gewoon geluk hadden gehad en twee ongewoon goed op elkaar afgestemde paden aan elkaar verbonden. Dus herhaalden ze de test, eerst het hechten van vier extra DNA-bindende domeinen aan dezelfde responsregulator en later het hechten van vijf DNA-bindende domeinen aan dezelfde sensorroute. De meeste van die herbedradingen werkten ook, wat aangeeft dat de aanpak veel meer modulair was dan alle eerder gepubliceerde benaderingen.

Schmidl, nu een assistent-professor biologie aan de RELLIS-campus van het Texas A&M University System in Bryan, verliet Rice in 2016. Mede-hoofdauteur Felix Ekness, een doctoraat student in Rice's Systems, Synthetische en Fysische Biologie (SSPB) programma, nam toen het project op, het ontwikkelen van tientallen nieuwe chimera's en het uitvoeren van honderden experimenten om aan te tonen dat de methode kan worden gebruikt om DNA-bindende domeinen tussen verschillende soorten bacteriën en tussen verschillende families van tweecomponentensystemen te mixen en matchen.

Tabor wist dat een topjournaal een demonstratie zou vereisen van hoe de technologie kan worden gebruikt, en het ontdekken van de functie van een totaal nieuw tweecomponentensysteem was de ultieme test. Voor deze, postdoctoraal onderzoeker Kristina Daeffler en SSPB Ph.D. student Kathryn Brink transplanteerde zeven verschillende onbekende tweecomponentensystemen van de bacterie Shewanella oneidensis in E. coli. Ze ontwikkelden een nieuwe E. coli-stam voor elke onbekende sensor, en gebruikten DNA-bindende domeinruil om al hun activiteiten te koppelen aan de expressie van groen fluorescerend eiwit.

Hoewel ze de invoer voor geen van de zeven wisten, ze wisten wel dat S. oneidensis werd ontdekt in een meer in de staat New York. Gebaseerd op dat, ze kozen 117 verschillende chemicaliën waarvan S. oneidensis baat zou kunnen hebben bij detectie. Omdat elke chemische stof één-op-één moest worden getest met elke mutant en een controlegroep, Brink moest er bijna 1 uitvoeren en nadoen. 000 afzonderlijke experimenten. De moeite werd beloond toen ze ontdekte dat een van de sensoren veranderingen in de pH detecteerde.

Een genomische zoektocht naar de nieuw geïdentificeerde sensor onderstreepte het belang van een hulpmiddel om tweecomponentensystemen te ontgrendelen:de pH-sensor kwam op in verschillende bacteriën, inclusief de ziekteverwekker die de builenpest veroorzaakt.

"Dit benadrukt hoe het ontsluiten van het mechanisme van tweecomponentensystemen ons zou kunnen helpen om ziekten beter te begrijpen en hopelijk ook beter te behandelen, ' zei Tabor.

Waar brengt Tabor de technologie nu naartoe?

Hij gebruikt het om de genomen van menselijke darmbacteriën te ontginnen voor nieuwe sensoren van ziekten, waaronder inflammatoire darmaandoeningen en kanker, met als doel een nieuwe generatie slimme probiotica te ontwikkelen die deze ziekten kunnen diagnosticeren en behandelen.