Wetenschap
Biomoleculaire condensaten:onderzoek onthult een slechte voorspellende kracht van gevestigde vloeistof-vloeistoffasescheidingstesten
Cellen bruisen van miljoenen verschillende biomoleculen die chaotisch door hun substructuren diffunderen, maar toch slagen ze erin een voortreffelijke functionele en ruimtelijke specificiteit te garanderen.
Verschillende biomoleculen werken specifiek samen in cellulaire processen en leiden tot gerichte cellulaire reacties. Dit wordt vaak bereikt door biomoleculen naar subcellulaire compartimenten te sturen. Compartimenten zoals mitochondriën worden ruimtelijk gescheiden door membranen. Anderen, zoals nucleoli, hebben helemaal geen membraangrenzen.
Hoe deze membraanloze compartimenten ontstaan, is nog steeds een van de grootste mysteries in de biologie. De afgelopen jaren is een fenomeen genaamd vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) voorgesteld als de drijvende kracht achter het samenstellen van compartimenten.
De groep van Andrea Musacchio, directeur van het Max Planck Instituut voor Moleculaire Fysiologie, heeft nu een validatiestrategie ontwikkeld om de rol van LLPS bij compartimentvorming te evalueren en om algemene methoden voor het detecteren van LLPS-eigenschappen te beoordelen. De studie is gepubliceerd in het tijdschrift Molecular Cell .
Het toepassen van de strategie op het proces van centromeerassemblage tijdens celdeling, waarvan werd voorgesteld dat het zou worden aangestuurd door een LLPS-scaffold (het chromosoompassagierscomplex of CPC), slaagde er niet in om LLPS als een cruciale motor te identificeren, wat de lage voorspellende kracht van deze tests bevestigde. . Deze nieuwe strategie heeft het potentieel om een belangrijk instrument te worden om de rol van andere potentiële LLPS-drivers die tot nu toe zijn geïdentificeerd, te valideren.
Eiwitten, die de meeste functies in ons lichaam vervullen door interactie met andere eiwitten, staan voor een dilemma:ze bewegen zich door de cel met 40 miljoen potentiële interactiepartners.
Het vinden van de juiste partner kan daarom lijken op het zoeken naar een speld in een hooiberg. Niettemin, ook al lijkt de kans dat een eiwit bij toeval de juiste partner op het juiste moment ontmoet klein, de cel heeft een strategie gevonden om eiwitten bij elkaar te brengen die lijkt op het ontmoeten van een potentiële partner op het werk, in een café of in de club:signalen leiden eiwitten naar gedefinieerde celcompartimenten, zoals het plasmamembraan of het mitochondrion.
Het proces van celdeling wordt bijvoorbeeld geïnitieerd door signaalprocessen op het celmembraan, die enzymen activeren waarvan de signalen uiteindelijk de celkern bereiken om gerichte gentranscriptie te activeren.
Tijdens de daaropvolgende celdeling leiden een groot aantal specifieke eiwitinteracties tot de vorming van een meerlaags eiwitcomplex op de centromeren van de chromosomen, wat zorgt voor een foutloze verdeling van de chromosomen in een moedercel naar zijn twee dochters.
P>De natuur heeft een bepaalde chemie ontwikkeld voor op elkaar inwerkende eiwitten:eiwitten die voor elkaar bedoeld zijn, zijn uitgerust met evolutionair geconserveerde en blootgestelde interfaces met gedetailleerde chemische identiteiten in hun 3D-structuur die complementair aan elkaar zijn. Deze motieven worden bij verschillende soorten aangetroffen en maken zeer specifieke eiwitinteracties mogelijk.
Een paradigmaverschuiving?
Rond de eeuwwisseling werden voor het eerst de eerste cellulaire compartimenten waargenomen die niet door fysieke grenzen werden begrensd. We weten nu dat nucleoli, P-lichamen of stresskorrels macromoleculen concentreren, voornamelijk eiwitten en RNA, en belangrijke functies hebben in de cel.
De ontdekking van deze membraanloze compartimenten heeft een nieuw onderzoeksveld geopend vol onbeantwoorde vragen, waarvan de meest uitdagende is hoe deze compartimenten worden gevormd en hoe ze hun structuur behouden.
De afgelopen jaren heeft het idee dat deze compartimenten ontstaan door een proces dat vloeistof-vloeistofontmenging of vloeistof-vloeistoffasescheiding wordt genoemd, vergelijkbaar met de spontane vorming van oliedruppeltjes in water, aanzienlijk aan kracht gewonnen.
Volgens deze opvatting zijn membraanloze compartimenten ‘condensaten’ waarvan de vorming gebaseerd is op voorbijgaande, zwakke en niet-specifieke interacties van ‘driver’-eiwitten, waardoor hun accumulatie daar uiteindelijk ontstaat in een hogere concentratie dan in het omringende medium.
Tests die de fasescheidingseigenschappen van eiwitten buiten de cel onderzoeken, hebben tot nu toe tientallen van deze factoren geïdentificeerd, waaronder het chromosomale passagierscomplex (CPC), waarvan wordt beweerd dat het condensaten vormt in het centromeer om de organisatie en functie ervan tijdens mitose te moduleren.
In vitro is niet in vivo:je kunt het cytosol niet verwaarlozen
"Voor veel wetenschappers is fasescheiding de standaardverklaring geworden voor de vorming van membraanloze compartimenten. Er is echter weinig bewijs dat in vitro LLPS-tests echt een fysiologisch proces in de celomgeving kunnen voorspellen", zegt Musacchio.
Samen met zijn team heeft hij een strategie ontwikkeld om een veelgebruikte LLPS-test en zijn voorspellende kracht te evalueren, en deze toegepast op CPC.
"Naar onze mening is een grote zwakte van de tests dat ze het oplosmiddel niet met voldoende nauwkeurigheid modelleren. Het oplosmiddel definieert de oplosbaarheid van een eiwit en dus het vermogen ervan om met andere eiwitten te interageren."
Om de natuurlijke omgeving van de cel zo goed mogelijk na te bootsen, voegde de wetenschapper verdunde bacteriële of zoogdiercellysaten toe aan standaard LLPS-buffers. Zelfs bij sterk verdunde concentraties voorkwamen lysaten de vorming van condensaten volledig. Om te beoordelen hoe algemeen dit was, herhaalden de wetenschappers hetzelfde experiment met verschillende extra eiwitten, die allemaal LLPS-eigenschappen vertoonden in de standaardtest. En inderdaad, in alle gevallen loste toevoeging van cellysaten de "condensaten" op.
"Deze resultaten bevestigen onze veronderstelling dat de cellulaire omgeving effectief de niet-specifieke zwakke interacties buffert waarvan wordt gedacht dat ze in vitro LLPS veroorzaken", zegt Musacchio.
Slecht voorspellend vermogen
De interacties en functies van eiwitten in de cel worden sterk gereguleerd door zogenaamde post-translationele modificaties. Zo kan het gericht toevoegen of verwijderen van fosfaatgroepen op kritische plekken de interactie tussen twee eiwitten direct verstoren. Deze natuurlijke modificaties kunnen in het laboratorium worden nagebootst door mutaties en zijn de voorkeursmethode als het gaat om het onderzoeken van veel cellulaire processen.
Door mutaties te introduceren op vier residuen die betrokken zijn bij de herkenning van gefosforyleerde signalen, genereerde de wetenschapper een mutant van de CPC die niet kan worden gerekruteerd in centromeren en zich daar niet ophoopt. Niettemin vertoonde deze mutant nog steeds het volledige LLPS-potentieel in de in vitro test, wat aantoont dat de test niet in staat is de CPC-lokalisatie en -functie te voorspellen.
"Onze resultaten laten zien dat LLPS van een enkele component in vitro de oplosbaarheid en lokalisatie in de complexe en drukke omgeving van de cel niet kan voorspellen. De lijst van vermeende LLPS-scaffolds die via de gevestigde testen zijn geïdentificeerd, zal uitgebreid opnieuw moeten worden onderzocht, en de validatiestrategie die we hebben die hier presenteren kunnen een leidraad zijn voor deze inspanning", zegt Musacchio.
"In de toekomst zijn we van plan onze experimenten te herhalen met veel vermeende LLPS-scaffolds, vooral degenen die vlaggenschepen zijn geworden in de groei van het LLPS-veld. Onze experimenten laten zien dat het cytosol een krachtig oplosmiddel is waarvan de rol niet kan worden verwaarloosd. Daarom is het Het zal belangrijk zijn om geschikte cytomimetische media te ontwikkelen als standaard voor het beoordelen van biochemische reacties in vitro. We zullen proberen een bijdrage te leveren aan dit onderzoeksgebied."