Wetenschap
Testen hoe goed biomarkers werken:nieuwe fluorescentiemicroscopiemethode kan de resolutie verbeteren tot op de Ångström-schaal
LMU-onderzoekers hebben een methode ontwikkeld om te bepalen hoe betrouwbaar doeleiwitten kunnen worden gelabeld met behulp van superresolutie-fluorescentiemicroscopie.
Moderne microscopietechnieken maken het mogelijk om de interne werking van cellen tot in verbazingwekkend detail te onderzoeken. "We kunnen nu de rangschikking en interactie van individuele eiwitten onder de microscoop observeren", zegt professor Ralf Jungmann, voorzitter van Molecular Physics of Life bij LMU en Max Planck Fellow bij de MPI of Biochemistry.
Het team van de biofysicus heeft onlangs de revolutionaire RESI-methode (Resolution Enhancement by Sequential Imaging) ontwikkeld. Deze techniek kan worden gebruikt om de resolutie van fluorescentiemicroscopie te verbeteren tot op de Ångström-schaal, ver onder de klassieke diffractielimiet van licht. Cruciaal hiervoor zijn DNA-geconjugeerde markermoleculen, die de onderzoekers precies hechten aan de moleculen die ze beter willen begrijpen.
Het team van Jungmann heeft nu een techniek gepresenteerd in het tijdschrift Nature Methods die kunnen worden gebruikt om te kwantificeren hoe goed biomarkermoleculen aan de doeleiwitten binden. "Dit is absoluut cruciaal als je kwantitatief betrouwbare uitspraken wilt doen", legt de natuurkundige uit.
Als u de etiketteringsefficiëntie kent, kunt u op deze manier ruimtelijk opgeloste proteomics uitvoeren. Hiermee kun je niet alleen achterhalen wat individuele eiwitten in een cel doen, maar ook in hoeverre ze aanwezig zijn en hoe hun hoeveelheid en gedrag onder bepaalde omstandigheden veranderen. "Maar dit is alleen mogelijk als we kunnen beoordelen hoe goed de etikettering heeft gewerkt." Dit komt doordat alleen gelabelde eiwitten onder de microscoop lichtflitsen uitzenden en zo zichtbaar worden.
De door het team van Jungmann ontwikkelde methode maakt deze beoordeling mogelijk door een referentiebiomarker aan de doeleiwitten toe te voegen. Deze marker "gloeit" tijdens microscopie in een andere kleur, waardoor succesvol gemarkeerde eiwitten in twee kleuren verschijnen.
Het team van Jungmann demonstreerde dit onder meer met behulp van het membraaneiwit CD86:de referentie produceert een roze fluorescentie, de eigenlijke marker een blauwachtige fluorescentie. Hierdoor ontstaat een patroon van ontelbare roze en blauwe lichtpunten. Waar de markering niet werkte, licht alleen de referentie afzonderlijk op. De markeerefficiëntie wordt berekend op basis van de verhouding tussen dubbel en enkelvoudig verlichte moleculen.
De methode biedt verschillende voordelen vergeleken met eerdere methoden voor het bepalen van de bindingsefficiëntie. "Het werkt niet alleen in vitro, maar ook in vivo, dat wil zeggen in de context van intacte cellen", legt Jungmann uit. "De techniek kan ook worden toegepast op een verscheidenheid aan verschillende doelmoleculen, biomarkers en monsters en is compatibel met een hele reeks superresolutiemethoden."
Een betrouwbare en breed toepasbare manier om de efficiëntie van markers te beoordelen is van cruciaal belang om nauwkeurige gegevensevaluatie te garanderen en betrouwbare vergelijkingen tussen verschillende bindmiddelen, etiketteringsomstandigheden en onderzoekslaboratoria mogelijk te maken.
De auteurs van het onderzoek zijn er zeker van dat de nieuwe kwantificeringsmethode de weg heeft vrijgemaakt voor een aanzienlijke uitbreiding van het potentieel van hun superresolutiemicroscoopmethode:‘Nu kunnen we ook specifieke biomedische toepassingen overwegen waarin de kwantitatieve detectie van eiwitten en processen van groot belang is. belang”, zegt Jungmann.
Denk hierbij bijvoorbeeld aan kankeronderzoek, waarbij informatie over interacties tussen eiwitten op het celoppervlak en medicijnen met moleculaire resolutie essentieel is voor de ontwikkeling van nieuwe soorten medicijnen.