De gramkleuring is een differentiële kleuringsprocedure die laat zien welke bacteriën grampositief of gramnegatief zijn op basis van hun kleurvlek. Aceton alcohol is een reagens dat in dit proces wordt gebruikt om de kleurdifferentiatie te bieden. Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycanlaag en kleuren paars, terwijl gramnegatieve micro-organismen een beetje tot geen peptidoglycanlaag hebben en roze kleuren.
Primaire vlek-kristalviolet

Zodra een glaasje bacteriemonster is bereid, wordt kristalviolet gebruikt om het monster eerst te kleuren. Op dit punt zullen zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën paars lijken. Gewoonlijk wordt het kristalviolet 30 seconden op de dia aangebracht voordat overtollige vlekken met water worden weggewassen. Het kristalviolet kan een beetje hechten aan de peptidoglycan-lagen, zodat niet alle primaire vlekken met het water worden weggewassen.
Mordant-Jodium

Vervolgens wordt jodium gedurende één minuut aan het monster toegevoegd. Het fungeert als een bijtmiddel, dat dient om kleurstoffen in een kleurproces te fixeren. Jodium vervult deze functie door zich te binden aan het kristalviolet en een onoplosbaar complex te creëren dat veel beter hecht aan de dikke peptidoglycanlaag die in grampositieve bacteriecellen wordt aangetroffen dan alleen het kristalviolet. Er is geen wasstap met water na toevoeging van het jodium.
Ontkleuringsmiddel-alcohol

Als ontkleuringsmiddel kan aceton of ethylalcohol worden gebruikt. De alcohol lost lipiden op die gevonden worden in het buitenste celmembraan van gramnegatieve bacteriën, waardoor het kristalviolet-jodiumcomplex uit de dunnere peptidoglycanlaag kan lekken. De alcohol wordt gedurende 10 tot 20 seconden toegevoegd; het wordt op de dia gegoten totdat al het jodium is weggewassen en de afvoer kleurloos is. Op dit punt in het gramkleuringproces zijn gramnegatieve bacteriën kleurloos, terwijl grampositieve bacteriën nog steeds het kristalviolet behouden. Eenmaal voltooid, moet de dia worden gespoeld met water om het ontkleuringseffect te stoppen.
Tegenkleuring-Safranin

Safranin wordt vervolgens toegevoegd om de zichtbaarheid en het contrast met de kleurloze Gram-negatieve bacteriën te vergroten. Door de vlek lijken deze bacteriën roze onder de microscoop. Omdat de vlek aan het hele monster wordt toegevoegd, kleurt het ook grampositieve bacteriën, maar hoe donkerder het kristalviolet de lichtere safranin roze kleur verbergt. Nadat het objectglaasje gedurende ongeveer een minuut is overstroomd met safranine, wordt water gebruikt om overtollige vlekken weg te wassen die niet aan de bacteriecellen hechtten.