Een team van interdisciplinaire onderzoekers onder leiding van Penn State heeft technieken ontwikkeld om de efficiëntie van CRISPR-Cas9, de genoombewerkingstechniek die in 2020 de Nobelprijs opleverde, te verbeteren. Terwijl CRISPR-Cas9 sneller, goedkoper en nauwkeuriger is dan andere genbewerkingstechnieken methoden, volgens projectleider Xiaojun "Lance" Lian, universitair hoofddocent biomedische technologie en biologie aan Penn State, heeft de technologie beperkingen, vooral in toepassingen om de menselijke gezondheid te verbeteren.

De onderzoekers ontwikkelden een efficiënter en toegankelijker proces om CRISPR-Cas9-systemen toe te passen in menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), afgeleid van federaal goedgekeurde stamcellijnen, waarvan Lian zei dat ze de diagnostiek en behandelingen voor genetische aandoeningen enorm zouden kunnen bevorderen. De aanpak werd op 7 september gepubliceerd in Cell Reports Methods .

CRISPR-Cas9, wat staat voor geclusterde regelmatige interspaced korte palindroomherhalingen en CRISPR-geassocieerd eiwit 9, geeft wetenschappers de mogelijkheid om precieze locaties van genetische code te targeten om DNA te veranderen, wat kansen biedt om nieuwe diagnostische hulpmiddelen te creëren en mogelijk mutaties te corrigeren om genetische oorzaken te behandelen van ziekte.

"Het menselijk genoom is enorm en CRISPR-Cas9 maakt het voor wetenschappers mogelijk om een ​​gemuteerd gen te vinden en erop te richten om het te bestuderen," zei Lian.

CRISPR gebruikt een schijf met genetisch materiaal, bekend als plasmide-DNA, om geleid ribonucleïnezuur (RNA) af te leveren dat het Cas9-enzym op de precieze locatie van het doelgen positioneert. Wanneer het DNA is gelokaliseerd, bindt Cas9 zich eraan en knipt het uit, waardoor ander DNA de snee kan repareren. Onderzoekers kunnen dan zien hoe de verwijdering de expressie van het gen verandert. Maar volgens Lian zijn er problemen met de efficiëntie van de levering en bewerking van de huidige op DNA gebaseerde CRISPR-methoden.

"De levering van DNA CRISPR-effectoren is laag", zei hij. "Slechts 20% tot 30% van de beoogde cellen krijgt DNA voor het bewerken van genen bij gebruik van CRISPR. De levering van RNA aan cellen kan efficiënter zijn, maar wanneer regulier RNA wordt geïntroduceerd, kunnen cellen het als een virus zien. Ze vernietigen de RNA voordat het eiwitten kan maken - laten we zeggen in een kwestie van een paar uur - en daarmee de poging tot genbewerking te vernietigen."

Om het resultaat te verbeteren, veranderden de onderzoekers de manier waarop de genoombewerkingstools aan de stamcellen worden geleverd, met behulp van gemodificeerd RNA (modRNA). Het modRNA verschilt van plasmide-DNA doordat het een van de basissubstraten in RNA vervangt door een chemisch gemodificeerde versie, en het wordt gestabiliseerd door een sterkere structurele ondersteuning.

"Het modRNA bleek opmerkelijk efficiënter te zijn dan plasmide-DNA," zei Lian. "Ongeveer 90% van de cellen ontving het modRNA van een eenvoudige transfectie, dus het kon op zijn plaats blijven en zijn werk doen."

De onderzoekers ontdekten ook dat de tijd dat het modRNA aanwezig was ideaal was:lang genoeg om de cellen te modificeren, maar niet zo lang dat het off-target activiteit veroorzaakte. Maar modRNA introduceerde een ander probleem, volgens Lian.

Wanneer modRNA Cas9 met succes wordt afgeleverd aan het doelgen, creëert het een dubbelstrengs breuk in het genoom, die sommige cellen zullen proberen te repareren. Degenen die zichzelf repareren, kunnen de reparatie of 'mutatie' doorgeven aan hun nageslacht. Dit is het proces dat onderzoekers beter willen begrijpen, dus dit zijn de cellen die ze willen oogsten en bestuderen. Het probleem, zei Lian, is dat de meeste cellen met deze breuk het identificeren als een groot probleem met het genoom en zichzelf zullen vernietigen in plaats van zichzelf te proberen te repareren.

Om de toxische bijwerkingen van Cas9 te verminderen en bewerkte cellen te helpen overleven, introduceerde het team van Lian een klein eiwit waarvan bekend is dat het cellen helpt groeien. Volgens Lian remde dit toegevoegde eiwit de celdood en verbeterde de bewerkingsefficiëntie van Cas9 tot 84%.

De onderzoekers ontdekten ook dat het modRNA andere technieken voor het bewerken van genen zou kunnen verbeteren, zoals basisbewerking. Base-editing kan genen uitschakelen of mutaties in het genoom corrigeren door een eiwit te gebruiken om een ​​enkele nucleotide te veranderen in plaats van beide strengen te knippen, zoals CRISPR doet.

"We hebben stamcellen getransfecteerd met een op plasmide gebaseerd of een modRNA-gebaseerd basisbewerkingseiwit," zei Lian. "Onze op modRNA gebaseerde methode was met 68% meer dan vier keer efficiënter dan de op plasmiden gebaseerde techniek, met ongeveer 16%, bij het succesvol bewerken van het genoom."

Volgens Lian zullen onderzoekers, naarmate meer laboratoria voor genbewerking de efficiëntie en effectiviteit van genbewerking verbeteren, in staat zijn genen en hun functies sneller beter te begrijpen.

"Het menselijk lichaam heeft meer dan 20.000 genen, maar we bestuderen de functies van slechts ongeveer 10% van hen," zei Lian. "Het onderzoeken van het doel van elk overblijvend gen, één voor één, kan een leven lang duren. Het gebruik van gemanipuleerde stamcellen van onze zeer efficiënte genbewerkingstechnieken kan dit proces enorm versnellen." + Verder verkennen

Ziekten bestuderen met betere levering van hulpmiddelen voor het bewerken van genen