Polymerasekettingreactie, of PCR, is een techniek die één fragment van DNA in veel fragmenten kopieert - exponentieel veel. De eerste stap is bij PCR om het DNA te verwarmen zodat het denatureert, of smelt in enkele strengen. De structuur van DNA is als een touwladder waarin de sporten touwen zijn met magnetische uiteinden. De magneten verbinden om de sporten te vormen, baseparen genoemd, en weerstaan ​​dus weerstand tegen uit elkaar getrokken delen. Elk fragment van DNA smelt in afzonderlijke strengen bij verschillende temperaturen. Het begrijpen van hoe de DNA-structuur bij elkaar wordt gehouden door de afzonderlijke delen van DNA, zal inzicht geven waarom verschillende DNA-fragmenten bij verschillende temperaturen smelten en waarom dergelijke hoge temperaturen in de eerste plaats nodig zijn.

Smelten! Melting!

De eerste stap van PCR is om het DNA te laten smelten, zodat dubbelstrengs DNA wordt gescheiden in enkelstrengig DNA. Voor DNA van zoogdieren heeft deze eerste stap gewoonlijk betrekking op een warmte van ongeveer 95 graden Celsius (ongeveer 200 Fahrenheit). Bij deze temperatuur breken de waterstofbruggen tussen de A-T- en G-C-basenparen, of sporten in de DNA-ladder, uit elkaar, het dubbelstrengige DNA openritend. De temperatuur is echter niet warm genoeg om de fosfaat-suiker-backbone te doorbreken die de afzonderlijke strengen vormt, of de polen van de ladder. Volledige scheiding van enkele strengen bereidt ze voor op de tweede stap van PCR, die afkoelt om korte DNA-fragmenten, primers genaamd, de afzonderlijke strengen te laten binden.

Magnetische ritsen

Een reden waarom DNA is verhit tot de hoge temperatuur van 95 graden Celcius is dat hoe langer de dubbele DNA-streng is, hoe meer hij bij elkaar wil blijven. DNA-lengte is een factor die van invloed is op het smeltpunt dat is gekozen voor PCR op dat stukje DNA. De A-T- en G-C-basenparen in het dubbelstrengige DNA binden met elkaar om de dubbelstrengsstructuur bij elkaar te houden. Hoe meer opeenvolgende basenparen tussen twee enkelvoudige strengen gebonden zijn, hoe meer hun buren ook willen binden, en hoe sterker de aantrekkingskracht tussen de twee strengen wordt. Het is als een ritssluiting gemaakt van kleine magneten. Als je de rits sluit, willen de magneten vanzelf dichtritsbaar en geritst blijven.

Sterkere magneten Sterker vasthouden

Een andere factor die van invloed is op welke smelttemperatuur je moet kiezen voor je DNA-fragment is de hoeveelheid GC-basenparen die in dat fragment aanwezig zijn. Elk basenpaar is als twee minimagneten die aantrekken. Een paar gemaakt van G en C wordt veel sterker aangetrokken dan een A- en T-paar. Dus een stukje DNA dat meer G-C-paren heeft dan een ander fragment, zal een hogere temperatuur vereisen voordat het in enkele strengen smelt. DNA absorbeert op natuurlijke wijze ultraviolet licht - om precies te zijn op de 260 nanometer golflengte - en enkelstrengs DNA absorbeert meer licht dan dubbelstrengs DNA. Dus het meten van de hoeveelheid geabsorbeerd licht is een manier om te meten hoeveel je dubbelstrengs DNA heeft gesmolten tot enkele strengen. Het "magnetische ritssluiting" -effect van G-C- en A-T-basenparen zorgt ervoor dat een grafiek van de lichtabsorptie van dubbelstrengig DNA uitgezet tegen een toename in temperatuur sigmoïdaal is, gevormd als een S, en niet als een rechte lijn. De curve van de S vertegenwoordigt de teamwork-weerstand die de basenparen uitoefenen tegen de hitte omdat ze niet willen scheiden.

The Halfway Point

De temperatuur waarbij een lengte DNA smelt in enkele strengen wordt de smelttemperatuur genoemd, die wordt aangeduid met de afkorting "Tm." Dit geeft de temperatuur aan waarbij de helft van het DNA in een oplossing is gesmolten tot enkele strengen en de andere helft nog steeds in de vorm van een dubbele streng. De smelttemperatuur is verschillend voor elk fragment van DNA. Zoogdier-DNA heeft een G-C-gehalte van 40%, wat betekent dat de overige 60% van de basenparen As en Ts zijn. Het 40% G-C-gehalte zorgt ervoor dat zoogdier-DNA smelt bij 87 graden Celsius (ongeveer 189 Fahrenheit). Dit is de reden waarom de eerste stap van PCR op DNA van zoogdieren het is te verwarmen tot 94 graden Celsius (201 Fahrenheit). Slechts zeven graden warmer dan de smelttemperatuur en alle dubbele strengen zullen volledig smelten tot enkelvoudige strengen.