Western blotting is een van de meest voorkomende procedures in biochemische laboratoria. Kort gezegd, het scheidt proteïnen van een monster op grootte en test vervolgens met behulp van antilichamen om te bepalen of een bepaald eiwit aanwezig is. Het is niet alleen nuttig in onderzoek, maar ook in medische of diagnostische laboratoria; tests voor zowel HIV als de ziekte van Lyme omvatten bijvoorbeeld een enzymgebonden immunosorbentassay (ELISA) -test, gevolgd door een Western-blot als de ELISA positief test. Ondanks zijn populariteit heeft Western-blotting echter verschillende nadelen.

Niet-kwantitatieve

Klassieke Western-blots zijn niet-kwantitatief. Met andere woorden, hoewel ze onderzoekers kunnen vertellen of een bepaald eiwit aanwezig is, maken ze het niet mogelijk te kwantificeren hoeveel van het eiwit aanwezig is. Sommige biotechbedrijven verkopen nu kits waarmee onderzoekers of laboranten de hoeveelheid eiwit die aanwezig is met behulp van een standaardcurve kunnen kwantificeren - maar dit werkt alleen als er zuivere monsters van hetzelfde eiwit beschikbaar zijn. Bovendien kan het molecuulgewicht van een eiwit alleen worden geschat met Western-blotting, in plaats van exact te worden bepaald zoals met massaspectrometrie.

Antilichamen

Een Western-blot kan alleen worden uitgevoerd als primaire antilichamen tegen de eiwit van belang zijn beschikbaar. Hoewel antilichamen voor veel verschillende eiwitten verkrijgbaar zijn bij biotechbedrijven, zijn ze niet goedkoop; als primaire antilichamen niet beschikbaar zijn voor een bepaald eiwit, zal het niet mogelijk zijn om een ​​Western-blot uit te voeren op zoek naar dat specifieke eiwit. Bovendien kunnen onderzoekers willen bepalen of een eiwit op de een of andere manier is gemodificeerd - als het is gefosforyleerd (als er een fosfaatgroep aan is gehecht), en met de Western Blot-techniek hebben ze antilichamen nodig die specifiek zijn voor de gemodificeerde eiwit.

Training

Het kan een uitdaging zijn om een ​​Western-blot op de juiste manier uit te voeren en goede resultaten te behalen, dus het personeel moet goed opgeleid zijn. In dit, zoals in veel andere, is ervaring misschien wel de beste tutor; zelfs voor een ervaren technicus is een Western-blot tijdrovend. Het gelelektroforese-gedeelte van het experiment zal bijvoorbeeld typisch één tot twee uur in beslag nemen. Andere taken kunnen worden uitgevoerd terwijl de gel wordt uitgevoerd, natuurlijk, maar het experiment duurt nog steeds vrij lang om resultaten te krijgen.

Andere beperkingen

Antilichamen vertonen soms een binding buiten het doelwit, wat kan zorgen voor slechtere resultaten. Bovendien, met Western blotting, gebruik je een antilichaam tegen een specifiek eiwit, dus jouw resultaten zullen je alleen vertellen of dat eiwit aanwezig was. Hoge-resolutie massaspectrometrie onthult daarentegen alle eiwitten die in een monster aanwezig zijn, en in tegenstelling tot klassieke Western-blotting is het kwantitatief. Het is natuurlijk belangrijk om te onthouden dat massaspectrometrie veel duurder is en ook technisch uitdagender in gebruik vergeleken met Western-blotting.