Onderzoekers van Northwestern Medicine onder leiding van Ruli Gao, Ph.D., universitair docent Biochemie en Moleculaire Genetica, hebben een nieuw hulpmiddel voor genetische sequencing ontwikkeld dat de sequentieanalyse van genotypen en fenotypes van dezelfde cellen in tumoren versnelt, zoals beschreven in een studie gepubliceerd in Natuurcommunicatie .

Single-cell nanopore RNA-sequencing is een nieuwer type genetische sequencing die de huidige high-throughput single-cell RNA-sequencing-technieken van de volgende generatie sequencing (NGS), die alleen korte RNA-strengen kan sequencen, naar de derde generatie sequencing brengt. generatiesequencing (TGS), waarmee direct de volledige lengte van RNA's kan worden gemeten.

Het is echter ook bekend dat de geavanceerde techniek grote sequentiefouten veroorzaakt en ook afhankelijk is van sequencing met korte leesbewerkingen (waarbij overeenkomende NGS-gegevens worden gegenereerd om de identificatie van mobiele gegevens te begeleiden) of van het gebruik van een witte lijst met streepjescodes om de gegevens op te splitsen in echte cellen en afzonderlijke cellen. moleculen.

"Deze techniek is gebaseerd op celbarcodes en barcodes van afzonderlijke moleculen, wat wij unieke molecuul-identificatoren noemen, om een ​​hoge doorvoer te bereiken, dus je ziet de uitdagingen als gevolg van hogere sequentiefouten in barcodereeksen. De momenteel beschikbare methoden zijn afhankelijk van gegevens van de volgende generatie of zijn afhankelijk van een theoretische witte lijst om te herkennen welke echte celbarcodes en unieke molecuulidentificaties zijn", zegt Gao, die ook lid is van het Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center van de Northwestern University.

Om dit proces te verbeteren heeft het team van Gao scNanoGPS (single-cell Nanopore sequencing analyse of Genotypes and Phenotypes Simultaneably) ontwikkeld, een nieuwe sequencing-tool die volledig onafhankelijke deconvolutie van foutgevoelige long-reads in afzonderlijke cellen en afzonderlijke moleculen uitvoert.

"Om de toepassingen van nieuwe technologie in genomica-onderzoek verder te vergemakkelijken, construeert scNanoGPS aanvullende functionele modules om zowel genotypen (mutaties) als fenotypes (gen- en isovorm-expressies) in individuele cellen te berekenen op basis van high-throughput single-cell nanopore RNA-sequencing-gegevens, " zei Cheng-Kai Shiau, Ph.D., een postdoctoraal onderzoeker in het Gao-laboratorium en co-eerste auteur van het onderzoek.

scNanoGPS verhoogt de sequencing-doorvoer van honderden naar duizenden cellen, wat vergelijkbaar is met de huidige wijdverbreid toegepaste, op short-reads gebaseerde single-cell RNA-sequencing-technieken, en de expressieprofielen tussen short-read en long-read data komen volgens Gao zeer overeen.

"Dankzij de dekking van het hele genlichaam maken lang gelezen gegevens berekeningen mogelijk van splicing-isovormen en genetische veranderingen die grotendeels worden gemist door kort gelezen single-cell RNA-sequencing", aldus Gao.

Om hun tool te valideren, gebruikte het team van Gao scNanoGPS om niertumorcellen en lymfocyten te sequencen, waarbij ze ontdekten dat de cellen celtype-specifieke combinaties van isovormen en genetische mutaties tot expressie brengen.

"We hebben celtypespecifieke isovormen gevonden, waaronder zowel tumorcelspecifieke isovormen als immuuncelspecifieke isovormen, en hebben ook celtypespecifieke mutatieprofielen aangetoond binnen dezelfde tumoren", zegt Lina Lu, Ph.D., een postdoctoraal onderzoeker in de Gao-laboratorium en co-eerste auteur van het onderzoek.

"Het is bekend dat alternatieve splicing-isovormen een cruciaal post-transcriptiemechanisme zijn om de eiwitcomplexiteit in menselijke cellen te vergroten. We zijn verheugd te kunnen vaststellen dat scNanoGPS de directe meting van splicing-isovormen op het niveau van één cel mogelijk maakt", aldus Gao.

Wat toekomstige toepassingen betreft, hoopt Gao dat scNanoGPS kan worden gebruikt om celtype-specifieke isovormen te identificeren die bijdragen aan diverse menselijke ziekten zoals kanker, hartfalen en zelfs afstoting van orgaantransplantaties.

"Nieuwe technologieën maken het genereren van gegevens relatief eenvoudiger, maar onderzoekers kunnen nieuwe gegevenstypen niet effectief gebruiken zonder een robuust computerhulpmiddel. scNanoGPS vult een leemte tussen de technologieën en toepassingen. We hopen de krachtige, lang gelezen single-cell sequencing-technologie beschikbaar en toegankelijk te maken aan alle algemene laboratoria," zei Gao.

Meer informatie: Cheng-Kai Shiau et al, Long-read sequencing-analyses met hoge doorvoer van één cel van genotypen en fenotypes van dezelfde cellen in menselijke tumoren, Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-39813-7

Journaalinformatie: Natuurcommunicatie

Aangeboden door Northwestern University