MicroRNA's (miRNA's) zijn korte niet-coderende regulerende RNA's die de genexpressie post-transcriptioneel kunnen onderdrukken en worden daarom steeds vaker gebruikt als biomarkers van ziekte. Het detecteren van miRNA's kan moeilijk en duur zijn omdat ze amplificatie vereisen, labeling en radioactieve sondes. In een recent gepubliceerd rapport over wetenschappelijke vooruitgang , Arun Richard Chandrasekaran en medewerkers van het RNA Institute en Department of Biological Sciences, aan de Universiteit van Albany, Staatsuniversiteit van New York, gerapporteerd in één stap, niet-enzym microRNA-detectietest met behulp van conformationeel niet-reagerende DNA-nanoschakelaars.

De wetenschappers noemden de test 'miRacles, ' om 'micro-RNA-geactiveerde conditionele looping van gemanipuleerde schakelaars' af te korten. De test toonde subattomol- en single-nucleotidespecificiteit aan met behulp van een agarosegelelektroforese-uitlezing. In de experimenten, ze detecteerden cellulaire microRNA's van RNA-extracties verkregen uit differentiërende spieren op nanogramschaal. De wetenschappers presenteerden een kosteneffectieve experimentele opstelling om miRNA's in een tijdsbestek van een uur te detecteren om een ​​overtuigend alternatief te bieden voor de bestaande methoden van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en Northern blotting om de regulerende genetische materialen te kwantificeren.

miRNA's kunnen veel biologische processen reguleren tijdens normale fysiologische ontwikkeling en ziekte door celproliferatie te beïnvloeden, differentiatie en apoptose in vivo. De expressie van miRNA's kan worden gekwantificeerd in weefsels, cellen en lichaamsvloeistoffen als stabiele biomarkers voor cellulaire gebeurtenissen en ziektediagnose, het belang van hun detectie benadrukken. Hoe dan ook, miRNA-detectie is een uitdaging vanwege de lage abundantie, klein formaat en overeenkomsten in volgorde. De biomoleculen omvatten ongeveer 0,01 procent van het totale RNA-gehalte en individuele mRNA-kopieën per celbereik kunnen sterk variëren. Aanvullend, miRNA's in een familie kunnen verschillen door een enkele nucleotide, terwijl specifieke miRNA's kunnen worden gereguleerd tijdens ziekte en normale cellulaire functie. Als resultaat, de detectiestrategieën voor miRNA vereisen een hoge specificiteit en het vermogen om een ​​paar moleculen correct te identificeren uit een monster dat overvloedig aanwezig is met overheersende RNA-moleculen.

Traditionele methoden voor miRNA-detectie omvatten Northern blotting, kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR), next-generation sequencing en op microarray gebaseerde hybridisatie om het miRNA-signaal van ruis te scheiden. Van de aangegeven methoden, Northern blotting kan inheemse miRNA's direct identificeren, terwijl anderen vertrouwen op aanvullende etiketteringsmethoden of stapsgewijze amplificatie, toe te voegen aan de kosten, complexiteit en prestaties van detectie. Bijvoorbeeld, innovatieve DNA-nanostructuren kunnen worden gebruikt voor miRNA-detectie, waar verschillende onderzoeksgroepen eerder nanostructuren hebben gecombineerd met nanodeeltjes, hybridisatie kettingreacties en overgangsmetaal dichalcogenide nanosheets om het proces mogelijk te maken.

In het huidige werk, Chandrasekaran et al. ontwikkelde een relatief eenvoudig op DNA gebaseerd apparaat om een ​​complexe biomedische uitdaging op te lossen. In de miRacles-test, de wetenschappers gebruikten een 'slim reagens' dat is samengesteld uit rationeel ontworpen DNA-nanoschakelaars voor eenvoudige en kosteneffectieve native miRNA-detectie zonder gespecialiseerde apparatuur in het laboratorium te gebruiken. DNA-nanoschakelaars werden oorspronkelijk ontworpen als hulpmiddelen voor biofysica-experimenten met één molecuul en werden later erkend vanwege hun vermogen om biomoleculaire interacties te detecteren en te kwantificeren met behulp van gelelektroforese. Eerdere gezamenlijke onderzoeksinspanningen door hetzelfde onderzoeksteam waren gericht op moleculaire detectie om eiwitniveaus te kwantificeren en synthetische DNA-sequenties te detecteren als een proof-of-concept.

Het huidige werk ging in op voorbereidende studies en concepten om gebruiksklare gemultiplexte miRNA-detectie en -kwantificering te produceren. De wetenschappers analyseerden nanogrammen cellulaire RNA-extracten in een kort tijdsbestek met behulp van een experimentele opstelling die was gebouwd met behulp van gewone laboratoriumbenodigdheden. Ze ontwierpen de DNA-nanoschakelaar als een lineaire duplex die een lus vormde in de aanwezigheid van het miRNA-doelmolecuul. Om de nanoschakelaar te construeren, Chandrasekaran et al. gebruikte de DNA-origami-aanpak door korte oligonucleotiden te hybridiseren die complementair zijn aan een enkelstrengs DNA-scaffold.

Ze ontwierpen twee verre "detector" -strengen met uitsteeksels die complementair zijn aan verschillende segmenten van het doel-miRNA. Toen het miRNA het construct herkende en eraan bond, de schakelaar is opnieuw geconfigureerd van de lineaire "uit"-status naar de doorgeluste "aan"-status. Ze kwantificeerden de twee toestanden met behulp van standaard agarosegelelektroforese om het signaal te detecteren dat voortkomt uit de lusvormige nanoschakelaar. Het signaal werd alleen versterkt door een enkel miRNA van belang, de resultaten waren gunstig in vergelijking met de fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET)-techniek.

Om het concept te valideren, het team van onderzoekers koos een let-7b-doel-miRNA vanwege de sterk geconserveerde familie van meer dan een dozijn verwante miRNA's die varieerden met een of meer nucleotiden. Deze miRNA's waren geschikt vanwege hun cruciale rol in biologische functies en ontregeling bij meerdere menselijke ziekten. Om overspraak en ruis tussen de nanoswitch en het doel te elimineren, wat leidde tot een verminderde signaalintensiteit in vergelijking met een perfecte match, de wetenschappers hebben de nanoschakelaars rationeel opnieuw ontworpen. Om perfecte specificiteit te bereiken, ze destabiliseerden de interactie aan de kant met de mismatch. De resultaten van de studie illustreerden de hoge specificiteit van de aldus ontwikkelde test, een antwoord bieden op een belangrijke uitdaging in miRNA-detectie die culmineerde in een hoge signaal / ruisverhouding.

De lage abundantie van miRNA's vereiste ook een hoge detectiegevoeligheid, die de wetenschappers bereikten door het protocol te optimaliseren. Vervolgens voerden ze vergelijkbare experimenten uit voor twee andere varianten van miRNA's (miR-15a en miR-206), resulterend in subattomole tot single-attomole niveaus van detectie. Bijvoorbeeld, voor een lage concentratie van een doelmonster (6 pM), het signaal nam gedurende 4 uur toe, met weinig verandering buiten dat tijdsbestek.

miRNA's worden ook typisch bestudeerd in celculturen, weefselmonsters en lichaamsvloeistoffen en gemakkelijk te verwerken om totale RNA's op microgramschaal te verzamelen, samen met een subfractie van klein RNA. Voor deze, Chandrasekaran et al. gebruikte myoblastcellen als een surrogaatmodelsysteem voor spierdifferentiatie, met miR-206 als het primaire doelwit. Tijdens celkweek, ze identificeerden miRNA's in differentiërende skeletspieren, waar het molecuul miR-206 significant werd opgereguleerd tijdens late differentiatie. Toen de wetenschappers de ongedifferentieerde en gedifferentieerde spiercellen oogstten om kleine RNA's te extraheren, ze bevestigden celdifferentiatie met behulp van Western-blots en voerden immunocytochemie uit voor respectievelijk vroege en late differentiatiemarkers myogenine (Myog) en myosine zware keten (MHC). Aangezien individuele miRNA's het massa-deel per miljoen vormen van de totale RNA's, het detecteren van miRNA's is net zo uitdagend als het vinden van een naald in een hooiberg. Om de test voor biologische detectie te valideren, daarom, Chandrasekaran et al. begonnen met de minder complexe kleine RNA-subfractie. Waarbij de wetenschappers met behulp van de miR-206-doel nanoswitch een progressieve toename van miR-206-expressie in kleine RNA's waarnamen tussen ongedifferentieerde monsters en monsters die gedurende 1-4 dagen waren gedifferentieerd.

Omdat meerdere mRNA's ook hun expressie kunnen veranderen tijdens verschillende cellulaire of ziektestadia, het fenomeen vereiste extra detectiemogelijkheden. Om dit te bereiken in de experimentele opstelling, Chandrasekaran et al. gebruikte de programmeerbaarheid van nanoschakelaars en ontwikkelde een multiplexsysteem dat in staat is meerdere miRNA's van hetzelfde monster te detecteren. Ze plaatsten de detectorstrengen op de gewenste locaties van de DNA-steiger, wat resulteert in lussen van verschillende groottes wanneer gebonden aan het miRNA van het doelwit. De lusgrootte van de nanoswitch bepaalde zo de gelmigratie, wat resulteert in een unieke band op de gel voor nauwkeurige detectie. Voor het experiment, de wetenschappers kozen vier miRNA's die aanwezig zijn in spiercellen; miR-206, miR-125b, miR-24 en miR-133-3p en een negatieve controle miRNA; miR-39 specifiek voor de soort Caenorhabditis elegans.

Binnen 50 ng van kleine RNA's, de wetenschappers ontdekten de vier miRNA's op verschillende expressieniveaus, terwijl wordt bevestigd dat er geen detectie is met de negatieve controle. De multiplexstrategie stelde de wetenschappers in staat om miRNA-niveaus in een enkel monster direct te vergelijken, zonder etikettering of amplificatie. In totaal, het werk leverde een extra stap in de richting van het uitbreiden van de doorvoer van de miRacles-assay. De mogelijkheid kan worden uitgebreid om ook meer miRNA's per switch te huisvesten.

Op deze manier, Chandrasekaran et al. aanzienlijk vooruitgegaan van hun voorlopige proof-of-concept-detectie van synthetische DNA-sequenties; bewerkstelligen, karakteriseren en optimaliseren van een kant-en-klare miRNA-detectietest met biologische extracten. Het gedemonstreerde werk was een eerste voorbeeld om DNA-nanoschakelaars te gebruiken om miRNA's van een echt biologisch monster te detecteren. Hoewel de prestaties van de miRNA-assay concurrerend waren in vergelijking met andere veelgebruikte technieken, de selectiviteit van 1 nucleotide gezien in het huidige werk was moeilijk te bereiken met bestaande methoden. De gevoeligheid van miRacles presteerde ook beter dan Northern blotting en microarrays. De test zou miRNA's kunnen meten zonder amplificatie, met eenvoudigere protocollen en zonder de extra fout van extra monsterverwerking. Het protocol mengde eenvoudig de nanoschakelaars met de monstervloeistof voor gelelektroforese, om in het laboratorium resultaten van hoge kwaliteit te produceren. Het onderzoekswerk is mogelijk overdraagbaar van biologische naar klinische monsters om ziekten te diagnosticeren en te volgen.

Belangrijker, het huidige werk sluit aan bij het bredere concept van sobere wetenschap; een veelbelovende visie op kosteneffectieve wetenschap die al goedkope oplossingen heeft opgeleverd voor bloedcentrifugering en waterzuiveringstechnieken in de biomedische technologie. Chandrasekaran et al. willen blijven bijdragen aan de opkomende trend in de wetenschap, door de bestaande relatie tussen kosten en prestaties te verstoren om brede toegang te bieden tot eenvoudige miRNA-detectiemethoden met slimme mix-and-read-reagentia.

© 2019 Wetenschap X Netwerk