Recombinant DNA (deoxyribonucleïnezuur is een synthetisch type nucleïnezuur dat wordt gecreëerd door DNA-sequenties aan elkaar te koppelen die van nature niet zouden bestaan ​​onder normale omstandigheden en omgevingsomstandigheden.) Het proces voor het maken van recombinant DNA wordt gemaakt door een geavanceerde procedure in de biologie en genetica die bekend staat als genklonen Recombinant DNA wordt in een cel geplaatst, die vervolgens een volledig nieuw eiwit produceert, en wordt gebruikt om medicijnen, antilichamen of specifieke eiwitten voor onderzoek te synthetiseren.

Introductie

DNA van een donororganisme of biologische bron wordt eerst uit cellen geëxtraheerd en vervolgens onderworpen aan een snijproces dat bekend staat als enzymatische beperking. Dit genereert DNA-fragmenten die het gen of de genen van belang bevatten. "gekloond" (dat wil zeggen ingevoegd) of op fragmenten van het ontvangende organisme geplakt en vervolgens in grotere DNA-moleculen ("plasmiden") ingevoegd die in een bacterie worden geplaatst en vermenigvuldigen. Het recombinante DNA wordt vervolgens teruggewonnen en geverifieerd.

DNA-isolatie

DNA moet eerst worden geëxtraheerd en gezuiverd van andere cellulaire moleculen, zoals ribonucleïnezuren (RNA's), eiwitten en structuren zoals cellen membranen. Voor kloneringdoeleinden wordt DNA uit de kern verkregen en is bekend als "genomisch DNA". Een gebruikelijke methode voor DNA-extractie is door ultracentrifugatie van celcomponenten in een dichtheidsgradiënt opgemaakt met ethidiumbromide in cesiumchloride. Als alternatief kan een reeks van alkalische en zout-bufferwassen ook worden gebruikt om het DNA te herstellen. Zodra dit is neergeslagen en gereinigd van alle andere ongewenste verontreinigingen, kan het DNA in fragmenten worden gesneden.

Beperking Enzymdigestie van DNA

Restrictie-enzymen zijn enzymen die zeer specifieke DNA-sequenties verknippen; ze worden gebruikt om unieke DNA-fragmenten te maken. Dit proces zorgt ervoor dat er geen onnauwkeurige, onjuiste of ongewenste sequenties worden gegenereerd die per ongeluk worden geïncorporeerd in het uiteindelijke recombinante DNA, wat kan resulteren in zowel experimentele mislukking als celdood. Om de gewenste DNA-fragmenten te genereren, wordt een specifieke enkele (of combinatie van) enzym (en) gebruikt om het DNA te knippen of te verteren. De fragmenten worden vervolgens gezuiverd door middel van gelelektroforese, die hen scheidt van het ongewenste DNA. Een ruwere methode omvat eenvoudigweg mechanisch knippen, waarbij de langere DNA-segmenten worden opgescheurd in kleinere die kunnen worden gebruikt voor klonen.

DNA-ligatie

Ligatie is het proces waarbij de donor wordt geplakt of samengevoegd en ontvanger (of vector) DNA-fragmenten om een ​​recombinant DNA-molecuul te creëren. Idealiter zouden de restrictie-enzymen die zijn gekozen om de fragmenten te maken zorgvuldig zijn uitgedacht en zo ontworpen dat ze toestaan ​​dat deze bits als een legpuzzel worden samengesteld. Om dit te doen hebben restrictie-enzymen die compatibele "kleverige uiteinden" produceren de voorkeur, zodanig dat alle compatibele fragmenten van nature met elkaar zullen worden verbonden; anders kan het DNA-ligase-enzym worden gebruikt om de DNA-segmenten te verbinden met fosfodiësterbindingen.

Recombinante DNA-replicatie

Het proces van transformatie of hitteshock wordt gebruikt om het recombinante DNA-molecuul in een gastheerbacteriecel, die vervolgens vele kopieën van het synthetische DNA kan genereren. Deze bacteriën worden gekweekt op agarplaten, gekweekt in speciale bacteriële bouillons en vervolgens gelyseerd om het recombinante DNA vrij te maken. Ten slotte kan het DNA worden geverifieerd door DNA-sequencing, functionele experimenten en digestie met restrictie-enzymen.