Als onderdeel van een internationaal onderzoeksteam, Jeff Donatelli, Peter Zwart en Kanupriya Pande van het Center for Advanced Mathematics for Energy Research Applications (CAMERA) van het Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) droegen sleutelalgoritmen bij die hielpen een doel te bereiken dat meer dan 40 jaar geleden voor het eerst werd voorgesteld - met behulp van hoekcorrelaties van röntgenstralen snapshots van niet-kristallijne moleculen om de 3D-structuur van belangrijke biologische objecten te bepalen. Deze techniek heeft het potentieel om wetenschappers in staat te stellen licht te werpen op de biologische structuur en dynamiek die voorheen onmogelijk waren waar te nemen met traditionele röntgenmethoden.

De doorbraak was het resultaat van een diffractie-experiment met één deeltje dat werd uitgevoerd bij de Linac Coherent Light Source (LCLS) van het Department of Energy (DOE's) door het Single-Particle Initiative, georganiseerd door het SLAC National Accelerator Laboratory. Als onderdeel van dit initiatief, het CAMERA-team heeft de krachten gebundeld met Ruslan Kurta, een fysicus bij de Europese XFEL-faciliteit (X-ray Free Electron Laser) in Duitsland, om hoekcorrelaties uit de experimentele gegevens te analyseren en CAMERA's multi-tiered iterative phasing (M-TIP) algoritme te gebruiken om de eerste succesvolle 3D-virusreconstructies uit te voeren op basis van experimentele correlaties. De resultaten werden beschreven in een paper gepubliceerd op 12 oktober in Fysieke beoordelingsbrieven .

"De afgelopen 40 jaar dit werd beschouwd als een probleem dat niet kon worden opgelost, zei Peter Zwart, co-auteur van het papier en een fysisch biowetenschapper die lid is van CAMERA, gebaseerd op de Molecular Biophysics and Integrated Imaging Division van Berkeley Lab. "Maar het blijkt dat de wiskundige hulpmiddelen die we hebben ontwikkeld, in staat zijn om extra informatie te benutten die verborgen was in het probleem dat eerder over het hoofd werd gezien. Het is verheugend om te zien dat onze theoretische benadering leidt tot een praktisch hulpmiddel."

Nieuwe onderzoekskansen mogelijk gemaakt door XFEL's

Gedurende een groot deel van de vorige eeuw, de go-to-techniek voor het bepalen van moleculaire structuur met hoge resolutie is röntgenkristallografie, waarbij het van belang zijnde monster is gerangschikt in een groot periodiek rooster en wordt blootgesteld aan röntgenstralen die verstrooien en diffractiepatronen vormen die op een detector worden verzameld. Hoewel kristallografie succesvol is geweest bij het bepalen van veel structuren met een hoge resolutie, het is een uitdaging om deze techniek te gebruiken om structuren te bestuderen die niet gevoelig zijn voor kristallisatie of structurele veranderingen die van nature niet voorkomen in een kristal.

De oprichting van XFEL-faciliteiten, waaronder de Linac Coherent Light Source (LCLS) en de Europese X-FEL, hebben mogelijkheden gecreëerd voor het uitvoeren van nieuwe experimenten die de beperkingen van traditionele kristallografie kunnen overwinnen. Vooral, XFEL-stralen zijn verschillende ordes van grootte helderder dan en hebben veel kortere pulslengtes dan traditionele röntgenlichtbronnen, waarmee ze meetbare diffractiesignalen van kleinere niet-gekristalliseerde monsters kunnen verzamelen en ook snelle dynamiek kunnen bestuderen. Single-particle diffractie is zo'n opkomende experimentele techniek mogelijk gemaakt door XFELS, waar men diffractiebeelden verzamelt van afzonderlijke moleculen in plaats van kristallen. Deze single-particle technieken kunnen worden gebruikt om moleculaire structuur en dynamica te bestuderen die moeilijk te bestuderen waren met traditionele beeldvormingstechnieken.

Beperkingen in beeldvorming van één deeltje overwinnen via hoekcorrelaties

Een grote uitdaging van beeldvorming met één deeltje is die van oriëntatiebepaling. "In een experiment met één deeltje, je hebt geen controle over de rotatie van de deeltjes als ze worden geraakt door de röntgenstraal, dus elke momentopname van een succesvolle treffer bevat informatie over het monster vanuit een andere richting, " zei co-auteur Jeff Donatelli, een toegepast wiskundige in CAMERA die veel van de algoritmen in het nieuwe raamwerk heeft ontwikkeld. "De meeste benaderingen voor analyse van één deeltje waren tot nu toe gebaseerd op het proberen om deze deeltjesoriëntaties uit de afbeeldingen te bepalen, maar, de beste resolutie die met deze analyses kan worden bereikt, wordt beperkt door hoe precies deze oriëntaties kunnen worden bepaald op basis van gegevens met veel ruis."

In plaats van te proberen deze oriëntaties direct te bepalen, het team koos voor een andere aanpak op basis van een idee dat oorspronkelijk in de jaren zeventig was voorgesteld door Zvi Kam. "In plaats van de individuele gegevensintensiteiten te onderzoeken in een poging om de juiste oriëntatie voor elk gemeten frame te vinden, we elimineren deze stap helemaal door zogenaamde kruiscorrelatiefuncties te gebruiken, ' zei Kurta.

Deze aanpak, bekend als fluctuatie röntgenverstrooiing, is gebaseerd op het analyseren van de hoekcorrelaties van ultrakorte, intense röntgenpulsen verspreid door niet-kristallijne biomoleculen. "Het mooie van het gebruik van correlatiegegevens is dat het een uitgebreide vingerafdruk van de 3D-structuur van een object bevat die de traditionele benaderingen van oplossingsverstrooiing uitbreidt, ' zei Zwart.

3D-structuur reconstrueren op basis van correlaties met het M-TIP-algoritme van CAMERA

De doorbraak van het team in het reconstrueren van 3D-structuren op basis van correlatiegegevens werd mogelijk gemaakt door het multi-tiered iterative phasing (M-TIP) algoritme dat is ontwikkeld door CAMERA. "Een van de prominente voordelen van M-TIP is het vermogen om de structuur rechtstreeks op te lossen uit de correlatiegegevens zonder te hoeven vertrouwen op enige symmetriebeperkingen, en, belangrijker, zonder de noodzaak om het oriëntatiebepalingsprobleem op te lossen, ' zei Donatelli.

Donatelli, CAMERA-directeur James Sethian en Zwart ontwikkelden hun M-TIP-raamwerk door een wiskundige generalisatie te ontwikkelen van een klasse van algoritmen die bekend staat als iteratieve faseringstechnieken, die worden gebruikt voor het bepalen van de structuur in een eenvoudiger probleem, bekend als fase ophalen. Een paper waarin het originele M-TIP-raamwerk wordt beschreven, werd in augustus 2015 gepubliceerd in de Proceedings van de National Academy of Sciences .

"Geavanceerde correlatieanalyses in combinatie met ab-initio-reconstructies door M-TIP definiëren duidelijk een efficiënte route voor structurele analyse van objecten op nanoschaal bij XFEL's, ' zei Zwart.

Toekomstige aanwijzingen voor correlatieanalyse en M-TIP

Het team merkt op dat methoden die in deze analyse worden gebruikt, ook kunnen worden toegepast om diffractiegegevens te analyseren wanneer er meer dan één deeltje per opname is.

"De meeste algoritmen voor beeldvorming van enkelvoudige deeltjes kunnen slechts één molecuul tegelijk aan, waardoor signaal en resolutie worden beperkt. Onze aanpak, anderzijds, is schaalbaar, zodat we ook meer dan één deeltje tegelijk moeten kunnen meten, ", zei Kurta. Beeldvorming met meer dan één deeltje per schot zal wetenschappers in staat stellen veel hogere hitrates te bereiken, omdat het gemakkelijker is om een ​​brede straal te gebruiken en veel deeltjes tegelijk te raken, en vermijdt ook de noodzaak om treffers met één deeltje te scheiden van treffers met meerdere deeltjes en blanco schoten, wat een andere uitdagende vereiste is bij traditionele beeldvorming met één deeltje.

Als onderdeel van CAMERA's reeks rekenhulpmiddelen, ze hebben ook een andere versie van M-TIP ontwikkeld die het oriëntatieprobleem oplost en de afbeeldingen kan classificeren in conformationele toestanden, en kan bijgevolg worden gebruikt om kleine biologische verschillen in het gemeten monster te bestuderen. This alternate version of M-TIP was described in a paper published June 26 2017 in the Proceedings van de National Academy of Sciences and is part of a new collaboration initiative between SLAC National Accelerator Laboratory, CAMERA, the National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Los Alamos National Laboratory as part of DOE's Exascale Computing Project (ECP).