Onderzoekers van de Harvard Medical School hebben het ontwerp van kleine nanoschijfjes verbeterd - synthetische modellen van celmembranen die worden gebruikt om eiwitten te bestuderen die bepalen wat een cel binnenkomt en verlaat. De verbeteringen bieden een ongekend beeld van hoe virussen cellen infecteren.

De nieuwe nanodiscs zijn stabieler dan eerdere versies en, Voor de eerste keer, kan worden gemaakt in verschillende precieze maten en vormen.

"We hebben eindelijk een gedefinieerde omgeving waar we kunnen bestuderen hoe virussen of andere eiwitten interageren met membraaneiwitten en details krijgen zoals nooit tevoren, zei Gerhard Wagner, de Elkan Blout hoogleraar biologische chemie en moleculaire farmacologie bij HMS en senior auteur van de studie.

Dankzij de ontwerpverbeteringen kunnen wetenschappers nu onder een microscoop kijken als virussen - in dit geval poliovirussen - koppelen aan de nanodiscs, openen een porie en injecteren hun genetisch materiaal.

"Een van de belangrijkste doelen in de virologie is om stap voor stap te begrijpen hoe virussen cellen binnendringen en om een ​​'moleculaire film' te maken, '", zei eerste auteur Mahmoud Nasr, een research fellow in het Wagner lab. "De hoop is dat deze nanodiscs ons zullen helpen meer details over dit proces te verzamelen, zodat we vaccins en medicijnen met kleine moleculen kunnen ontwerpen om het binnendringen van virussen te voorkomen."

In aanvulling, het inbedden van verschillende eiwitten in de nanodiscs en het ronddraaien in nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectrometers levert scherpere beelden op van de structuren en dynamiek van de eiwitten dan voorheen mogelijk was, onderzoekers helpen de functies van de eiwitten in het lichaam beter te begrijpen.

De bevindingen werden gerapporteerd in Natuurmethoden op 21 november.

De riem vastmaken

Zogenaamde fosfolipide dubbelgelaagde nanodiscs zijn in feite bundels vet die rond de taille worden vastgemaakt door een paar eiwitriemen. de vetten, of lipiden, vormen een dubbele laag zoals die van het natuurlijke celmembraan. Wetenschappers kunnen dan membraaneiwitten inbedden in de dubbellaag.

Nanodiscs ontstonden in het begin van de jaren 2000 als alternatief voor andere membraansurrogaten die te groot of onstabiel zijn of waarvoor reinigingsmiddelen nodig zijn, die interfereren met de natuurlijke eiwitdynamiek. Maar nanodiscs presenteerden hun eigen problemen. Bijvoorbeeld, onderzoekers konden ze niet in consistente maten maken, testresultaten weggooien.

Wagners team erkende dat het probleem waarschijnlijk lag in het feit dat de eiwitgordels rond de nanodiscs openstonden, zodat de schijven explodeerden met ongelijke hoeveelheden lipiden.

Zowaar, toen de wetenschappers wat mooie scheikunde deden om de riemen vast te maken, de nanodiscs kwamen uit in een veel smaller bereik. De schijven hielden ook beter bij elkaar in de loop van de tijd en bij de hoge temperaturen die nodig zijn voor NMR-experimenten.

De onderzoekers ontdekten dat ze de riemen konden inkorten of verlengen en toch sluiten, waardoor de nanodiscs op maat kunnen worden gemaakt om op specifieke membraaneiwitten te passen. Tot dusver, ze hebben schijven gemaakt met een diameter van 9, 11, 15 en 50 nanometer.

Het vermogen om de grootte van nanodiscs te regelen, vergroot de bruikbaarheid van de tools voor een reeks eiwitten en technologieën. NMR vereist kleine schijven en eiwitten, bijvoorbeeld, terwijl elektronenmicroscopie vaak grote nodig heeft.

"Je kunt kleine nanodiscs niet gebruiken om enorme eiwitcomplexen te bestuderen of naar virussen te kijken, die een minimaal oppervlak nodig hebben om een ​​porie te vormen, " zei Nasr.

De meeste nanoschijven zijn cirkelvormig, hoewel de wetenschappers ook sleutelen aan een reeks veelhoekige vormen, van driehoeken tot zeshoeken.

"We hopen dat door efficiënter samen te verpakken dan circulaire nanodiscs, de veelhoekige nanoschijven, vooral als we kleinere kunnen maken, zal ons helpen goede kristallen te laten groeien, wat ons een andere manier biedt om de structuren op te lossen van de membraaneiwitten die we erin insluiten, " zei Nasr.

Virale zoeker

In de gang van Wagners lab, James Hogle, de Edward S. Harkness hoogleraar biologische chemie en moleculaire farmacologie aan de HMS, en zijn postdoctorale collega Mike Strauss liepen tegen blokkades aan om te leren hoe simpele virussen, zoals poliovirussen, in de cellen komen.

"Er moet iets over het membraan gaan, " zei Hogle. Er was enig bewijs dat poliovirussen poriën in het membraan openden en alleen hun genetisch materiaal erdoorheen stuurden, maar de modelsystemen die de onderzoekers gebruikten, liposomen genoemd, waren te onregelmatig en onstabiel om te laten zien wat er in het membraan gebeurde.

"We konden de stukjes waarin we geïnteresseerd waren niet zien, ' zei Hogel.

Benieuwd of de gemodificeerde nanodiscs een beter zicht gaven, Hogle en Strauss werkten samen met Wagner en Nasr.

Eerst, Nasr bouwde schijven van 50 nanometer die groot genoeg waren om alle puzzelstukjes te bevatten. Vervolgens heeft het team eiwitten ingebed in de nanodiscs die binden aan poliovirussen, poliovirusdeeltjes aan de mix toegevoegd, bevroor de monsters en nam snapshots door een cryo-elektronenmicroscoop.

"We vroegen het virus, 'Kom hechten aan de nanodisc, ga de cel in en laat ons zien wat je doet, '" legde Nasr uit.

Op de beelden was te zien dat enkele virusdeeltjes het aas pakken - zich hechten aan de receptoreiwitten, het openen van wat leek op poriën door de lipide dubbellaag en het vrijgeven van hun RNA alsof ze probeerden een echte cel te infecteren.

"Niemand had eerder zo'n porie gezien, " zei Nasr.

De onderzoekers hebben nog niet bevestigd dat de objecten die ze zien echt poriën zijn, maar, Hogle zei, "We weten dat ze er zijn omdat het RNA naar de overkant gaat."

"Ze zien er zeker uit als poriën, "voegde hij eraan toe. "Zoals ze zeggen, 'Als het loopt als een eend, en kwaakt als een eend...'"

Nasr probeert nu nog beter op maat gemaakte schijven van 30 nanometer te maken om Hogle's team te helpen de structuur van het poliovirus / receptoreiwitcomplex te bepalen en verder te graven in wat er in het membraan gebeurt.

"De nanodiscs zijn een spannende techniek, "zei Hogle. "Ik kan me geen andere manier voorstellen om te zien hoe de porie eruit ziet. Mahmoud was heel slim om deze werkend te krijgen en een systeem te creëren dat de deur opent voor een breed scala aan studies."

De onderzoekers hopen dat hun eerste resultaten anderen aanmoedigen om de nanodiscs te gebruiken om veel virus-receptor-interacties onder de loep te nemen. Reeds overspoeld met verzoeken om samenwerking, De groep van Wagner heeft een verzameling eiwitbanden beschikbaar gesteld en publiceert een gedetailleerd protocol zodat andere laboratoria de nanodiscs zelf kunnen bouwen.

Structuurdetail

Naast het bestuderen van virale invoer, Het team van Wagner toonde aan dat de nanodiscs de NMR-resultaten kunnen verbeteren en het mogelijk maken om meer membraaneiwitten te bestuderen met behulp van NMR. Deze omvatten G-eiwit gekoppelde receptoren, waar ongeveer 40 procent van de huidige medicijnen op gericht zijn.

"Met deze techniek we kunnen fantastische spectra krijgen, ' zei Wagner.

Omdat de nanodiscs niet kapot gaan bij hoge temperaturen, "we kunnen wekenlang NMR-experimenten doen, en de GPCR's worden niet afgebroken, " zei Nasr.

De nanodiscs lijken ook de eiwitten die erin zijn ingebed te stabiliseren.

"Ze zijn zeer resistent tegen eiwitsnijdende enzymen die naar binnen gaan en ze aanvallen, ' zei Wagner.