Antilichamen, verantwoordelijk voor het herkennen en zoeken naar moleculaire doelen, behoren tot de meest bruikbare instrumenten in de biologie en geneeskunde. Nanobodies – de kleine neven van antilichamen – kunnen dezelfde taken uitvoeren, bijvoorbeeld het markeren van moleculen voor onderzoek of het markeren van zieke cellen voor vernietiging. Maar, dankzij hun vergelijkende eenvoud bieden nanobodies het verleidelijke vooruitzicht dat ze veel gemakkelijker te produceren zijn.

Helaas, hun belofte is niet volledig gerealiseerd, omdat het wetenschappers ontbrak aan een efficiënte manier om de nanobodies te identificeren die het meest op hun doelwit zijn afgestemd. Echter, een nieuw systeem, ontwikkeld door onderzoekers van de Rockefeller University en hun medewerkers en vandaag beschreven in: Natuurmethoden , belooft nanobodies drastisch toegankelijker te maken voor allerlei soorten onderzoek.

Antilichamen zijn defensieve eiwitten die door het immuunsysteem worden ingezet om indringers te identificeren en te neutraliseren. Maar hun kracht kan ook op andere manieren worden benut, en ze worden gebruikt in de biologie en geneeskunde voor het visualiseren van cellulaire processen, zieke cellen aanvallen en specifieke moleculen op specifieke plaatsen afleveren. Net als hun grotere neven, nanobodies kunnen ook voor deze taken worden gebruikt, maar hun kleine formaat maakt het veel gemakkelijker om nanobodies in bacteriefabrieken te kweken. Ze hebben ook toegang tot moeilijk bereikbare plaatsen die mogelijk niet toegankelijk zijn voor grotere moleculen.

"Nanobodies hebben een enorm potentieel als veelzijdige en toegankelijke alternatieven voor conventionele antilichamen, maar helaas vormen de huidige technieken een knelpunt om aan de vraag ernaar te voldoen, " zegt studie auteur Michael Rout, hoofd van het laboratorium voor cellulaire en structurele biologie bij Rockefeller. "We hopen dat ons systeem nanobodies met hoge affiniteit meer beschikbaar zal maken, en openen vele nieuwe mogelijke toepassingen voor hen."

In hun eerste studies het team genereerde antilichamen met hoge affiniteit, degenen die in staat zijn om het meest nauwkeurig te binden aan hun doelen, gericht tegen twee fluorescerende eiwitten die biologen vaak gebruiken als markers om activiteit in cellen te visualiseren:GFP en mCherry. Hun nieuwe systeem, zoals bestaande voor het genereren van antilichamen, begint met een dier, in dit geval lama's gehuisvest in een faciliteit in Connecticut.

Lama's werden gekozen omdat de antilichaamvarianten die ze produceren gemakkelijk kunnen worden aangepast om nanobodies te genereren, die slechts een tiende van het gewicht van een gewoon antilichaam zijn. De lama's werden geïmmuniseerd met GFP en mCherry, hun immuunsysteem ertoe aanzetten om antilichamen tegen deze vreemde eiwitten te genereren.

"De sleutel was om een ​​relatief snelle manier te vinden om de genetische sequenties te bepalen van de antilichamen die met de grootste affiniteit aan de doelen binden. Tot nu toe was het verkrijgen van deze sequenties met hoge affiniteit een heilige graal, " zegt Brian Chait, Camille en Henry Dreyfus Professor en hoofd van het laboratorium voor massaspectrometrie en gasvormige ionenchemie bij Rockefeller. "Zodra die sequenties zijn verkregen, het is gemakkelijk om bacteriën te manipuleren om de antilichamen massaal te produceren."

De onderzoekers, onder leiding van promovendus Peter Fridy en postdoc Yinyin Li, begonnen met het maken van databases met antilichaamsequenties van RNA geïsoleerd uit antilichaamproducerende cellen in het beenmerg van de lama's. Volgende, ze haalden de strakst bindende GFP- en mCherry-antilichamen uit bloedmonsters van dezelfde lama's, en deze chemisch in kleinere stukjes snijden, alleen het antigeen-bindende gedeelte behouden om nanobodies te creëren.

Vervolgens bepaalden ze gedeeltelijke sequenties van de aminozuren die het eiwit van de nanobodies vormden met een techniek die bekend staat als massaspectrometrie. Met behulp van een computeralgoritme genaamd "llama magic, " ontwikkeld door David Fenyö en Sarah Keegan van de New York University School of Medicine, ze matchten de samenstelling van de nanobodies met de hoogste affiniteit met de originele RNA-sequentie. Met deze volgorde ze zouden bacteriën kunnen ontwikkelen om de nanobodies massaal te produceren voordat ze in experimenten worden gebruikt.

Antilichamen worden vaak gebruikt om een ​​bepaalde structuur in een cel te isoleren, zodat wetenschappers deze kunnen verwijderen en onderzoeken, en het team deed precies dat met hun nieuwe nanobodies. Ze zuiverden verschillende celstructuren die waren getagd met GFP of mCherry, en ook deze structuren in situ gevisualiseerd.

Globaal genomen, hun procedure genereerde 25 soorten nanobodies die in staat zijn zich nauwkeurig te richten op GFP en zes voor mCherry, een veel diversere reeks nanobodies met hoge affiniteit dan typisch mogelijk is met conventionele technieken.

Deze overvloed opent nieuwe mogelijkheden. Wetenschappers kunnen alleen de beste selecteren, het elimineren van nanobodies die bij toeval kruisreageren met andere moleculen, of rijg twee nanobodies aan elkaar die zich hechten aan verschillende plekken op hetzelfde doelwitmolecuul om een ​​dimeer met superhoge affiniteit te genereren, precies zoals de onderzoekers hebben aangetoond voor de GFP-nanobodies. Deze superhoge affiniteit zou een krachtig kenmerk kunnen zijn bij het afleveren van therapeutische of diagnostische moleculen, omdat het de vereiste dosering zou verlagen, en zo ongewenste bijwerkingen te verminderen.

"Aangezien we nu gemakkelijk suites van nanobodies met hoge affiniteit kunnen identificeren, de toekomst voor hen als onderzoeksinstrumenten, diagnostiek en therapie ziet er goed uit, ' zegt Rout.