Het multiplexvermogen van fluorescentiemicroscopie wordt ernstig beperkt door de brede spectrale breedte van de fluorescentie. Spectrale beeldvorming biedt mogelijke oplossingen, maar typische benaderingen om de lokale emissiespectra te verspreiden, belemmeren met name de haalbare doorvoer en leggen aanzienlijke beperkingen op aan de temporele resolutie. Afstembare banddoorlaatfilters bieden de mogelijkheid om door de emissiegolflengte in het brede veld te scannen. Echter, het toepassen van smalle bandpassages op de fluorescentie-emissie resulteert in inefficiënt gebruik van het schaarse signaal.

In een nieuw artikel gepubliceerd in Licht:wetenschap en toepassingen , een team van wetenschappers, onder leiding van professor Ke Xu van het College of Chemistry, Universiteit van Californië, Berkeley, VS hebben aangetoond dat het gebruik van een enkele, vaste fluorescentie-emissiedetectieband, door frame-gesynchroniseerd snel scannen van de excitatiegolflengte van een witte lamp via een akoestisch-optisch afstembaar filter (AOTF), tot 6 subcellulaire doelen, gelabeld door gemeenschappelijke fluoroforen van aanzienlijke spectrale overlap, kunnen gelijktijdig worden afgebeeld in levende cellen met lage (~ 1%) overspraak en hoge temporele resolutie (tot ~ 10 ms).

Het aangetoonde vermogen om de abundanties van verschillende fluoroforen in hetzelfde monster te kwantificeren door de excitatiespectra te ontmengen, stelde hen vervolgens in staat om nieuwe, kwantitatieve beeldvormingsschema's voor zowel bi-state als FRET (Förster-resonantie-energieoverdracht) fluorescerende biosensoren in levende cellen. Ze bereikten dus full-frame hoge gevoeligheden en spatiotemporele resoluties bij het kwantificeren van de pH van de mitochondriale matrix en de intracellulaire macromoleculaire crowding. Ze onthulden dus significante ruimtelijke heterogeniteiten in beide parameters, inclusief spontane plotselinge sprongen in de pH van de mitochondriale matrix, vergezeld van dramatische veranderingen in de mitochondriale vorm. Ze toonden verder aan, Voor de eerste keer, het multiplexen van absolute pH-beeldvorming met drie extra doelorganellen/eiwitten om het complex op te helderen, Door parkine gemedieerde mitofagieroute.

"De potentiële uitbreiding van onze benadering naar nog meer fluoroforen kan worden bereikt door het aantal excitatiegolflengten verder te vergroten of emissiedispersie te integreren. Terwijl we ons in dit werk concentreerden op een eenvoudig systeem op basis van een met een lamp bediende epifluorescentiemicroscoop, de snelle multi-fluorofoor en kwantitatieve biosensor-beeldvormingsmogelijkheden die we hier hebben gedemonstreerd, moeten gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar andere systemen, inclusief light-sheet fluorescentiemicroscopie en gestructureerde verlichtingsmicroscopie", merkten de wetenschappers op.

Samen, deze resultaten "onthullen de uitzonderlijke mogelijkheden die excitatiespectraalmicroscopie biedt voor zeer gemultiplexte fluorescentiebeeldvorming. Het vooruitzicht om snelle spectrale beelden in het brede veld te verkrijgen zonder de noodzaak van fluorescentiedispersie of de zorg voor de spectrale respons van de detector biedt een enorm potentieel, ’ concluderen de wetenschappers.