Het vermogen om zonlicht om te zetten in energie is een van de opmerkelijkere prestaties van de natuur. Wetenschappers begrijpen het basisproces van fotosynthese, maar veel cruciale details blijven ongrijpbaar, die zich voordoen op dimensies en vluchtige tijdschalen die lang als te minuscuul werden beschouwd om te onderzoeken.

Nutsvoorzieningen, dat is aan het veranderen.

In een nieuwe studie, geleid door Petra Fromme en Nadia Zatsepin in het Biodesign Center for Applied Structural Discovery, de School of Molecular Sciences en het Department of Physics aan de ASU, onderzoekers onderzochten de structuur van Photosystem I (PSI) met ultrakorte röntgenpulsen bij de European X-ray Free Electron Laser (EuXFEL), gevestigd in Hamburg, Duitsland.

PSI is een groot biomoleculair systeem dat fungeert als een zonne-energieomzetter die zonne-energie omzet in chemische energie. Fotosynthese levert energie voor al het complexe leven op aarde en levert de zuurstof die we inademen. Vooruitgang in het ontrafelen van de geheimen van fotosynthese belooft de landbouw te verbeteren en te helpen bij de ontwikkeling van zonne-energieopslagsystemen van de volgende generatie die de efficiëntie van de natuur combineren met de stabiliteit van door mensen ontworpen systemen.

"Dit werk is zo belangrijk, omdat het de eerste proof-of-concept toont van megahertz seriële kristallografie met een van de grootste en meest complexe membraaneiwitten in fotosynthese:Photosystem I", zegt Fromme. "Het werk effent de weg naar in de tijd opgeloste studies aan de EuXFEL om moleculaire films van het door licht gestuurde pad van de elektronen in fotosynthese of visualiseer hoe kankermedicijnen defecte eiwitten aanvallen."

De EuXFEL, die onlangs in bedrijf is genomen, is de eerste die een supergeleidende lineaire versneller toepast die opwindende nieuwe mogelijkheden oplevert, waaronder zeer snelle megahertz-herhalingsfrequenties van zijn röntgenpulsen - meer dan 9000 keer sneller dan enige andere XFEL - met pulsen die worden gescheiden door minder dan 1 miljoenste van een seconde. Met deze ongelooflijk korte uitbarstingen van röntgenlicht, onderzoekers zullen veel sneller moleculaire films van fundamentele biologische processen kunnen vastleggen en zullen waarschijnlijk gevolgen hebben voor diverse gebieden, waaronder geneeskunde en farmacologie, scheikunde, natuurkunde, materiaal kunde, energie onderzoek, milieustudies, elektronica, nanotechnologie, en fotonica. Petra Fromme en Nadia Zatsepin zijn co-corresponderende auteurs van het artikel, gepubliceerd in het huidige nummer van het tijdschrift Natuurcommunicatie .

Kracht in cijfers

Fromme is de directeur van het Biodesign Center for Applied Structural Discovery (CASD) en leidt de experimentele teaminspanningen van het project, terwijl Zatsepin het XFEL-gegevensanalyseteam leidde.

"Dit is een belangrijke mijlpaal in de ontwikkeling van seriële femtoseconde kristallografie, voortbouwend op de goed gecoördineerde inspanningen van een groot, interdisciplinair, internationaal team en jarenlange ontwikkelingen op verschillende gebieden", benadrukt Zatsepin, voormalig onderzoeksassistent-hoogleraar bij de ASU-afdeling Natuurkunde en Biodesign CASD, en nu Senior Research Fellow aan La Trobe University in Australië.

Christoffel Gisriel, de co-eerste auteur van het papier, werkte aan het project als postdoctoraal onderzoeker in het Fromme-laboratorium en is enthousiast over het project. "Snelle gegevensverzameling in seriële femtoseconde kristallografie-experimenten maakt deze revolutionaire techniek toegankelijker voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de structuur-functierelatie voor enzymen. Dit wordt geïllustreerd door onze nieuwe publicatie in Natuurcommunicatie waaruit blijkt dat zelfs de moeilijkste en meest complexe eiwitstructuren kunnen worden opgelost door seriële femtoseconde kristallografie terwijl gegevens worden verzameld met een herhalingssnelheid van megahertz."

"Het is heel opwindend om het harde werk te zien van de vele mensen die dit project hebben laten verwezenlijken, " zegt Jesse Coe, co-eerste auteur die vorig jaar afstudeerde met een Ph.D. in biochemie van ASU. "Dit is een enorme stap in de goede richting naar een beter begrip van het proces van elektronenoverdracht van de natuur dat in de loop van miljarden jaren is verfijnd."

Extreme wetenschap

Een XFEL (voor röntgenvrije-elektronenlaser) levert röntgenlicht dat een miljard keer helderder is dan conventionele röntgenbronnen. De briljante, laserachtige röntgenpulsen worden geproduceerd door elektronen die worden versneld tot bijna de lichtsnelheid en worden toegevoerd door de opening tussen reeksen alternerende magneten, een apparaat dat bekend staat als een undulator. De undulator dwingt de elektronen te wiebelen en zich op te stapelen tot discrete pakketjes. Elk van de perfect gesynchroniseerde wiebelende elektronenbundels zendt een krachtige, korte röntgenpuls langs de elektronenvluchtbaan.

In seriële femtoseconde kristallografie, een straal eiwitkristallen wordt bij kamertemperatuur in het pad van de gepulseerde XFEL-straal geïnjecteerd, structurele informatie opleveren in de vorm van diffractiepatronen. Van deze patronen wetenschappers kunnen atomaire schaalbeelden van eiwitten bepalen in bijna natuurlijke omstandigheden, de weg vrijmaakt voor nauwkeurige moleculaire films van moleculen aan het werk.

Röntgenstralen beschadigen biomoleculen, een probleem dat de inspanningen voor structuurbepaling al tientallen jaren plaagt, waarbij de biomoleculen moeten worden ingevroren om de schade te beperken. Maar de röntgenuitbarstingen die door een XFEL worden geproduceerd, zijn zo kort - slechts femtoseconden - dat röntgenverstrooiing van een molecuul kan worden geregistreerd voordat vernietiging plaatsvindt, vergelijkbaar met het gebruik van een snelle camerasluiter. Als referentiepunt is een femtoseconde een miljoenste van een miljardste van een seconde, dezelfde verhouding als een seconde is tot 32 miljoen jaar.

Door de verfijning, grootte en kosten van XFEL-faciliteiten, momenteel zijn er wereldwijd slechts vijf beschikbaar voor dergelijke experimenten - een ernstig knelpunt voor onderzoekers, aangezien elke XFEL doorgaans slechts één experiment tegelijk kan hosten. De meeste XFEL's genereren röntgenpulsen tussen 30 en 120 keer per seconde en het kan enkele uren tot dagen duren om de gegevens te verzamelen die nodig zijn om een ​​enkele structuur te bepalen, laat staan ​​een reeks frames in een moleculaire film. De EuXFEL is de eerste die een supergeleidende lineaire versneller gebruikt in zijn ontwerp, waardoor de snelste opeenvolging van röntgenpulsen van elke XFEL mogelijk is, waardoor de tijd die nodig is om elke structuur of elk frame van de film te bepalen aanzienlijk kan worden verkort.

Hoog risico, hoge beloning

Omdat het monster wordt vernietigd door de intense röntgenpulsen, het moet op tijd worden aangevuld voor de volgende röntgenpuls, waarvoor PSI-kristallen 9000 keer sneller moesten worden afgeleverd bij de EuXFEL dan bij eerdere XFEL's - met een straalsnelheid van ongeveer 50 meter per seconde (160 voet per seconde), als een microfluïdische brandslang. Dit was een uitdaging omdat er grote hoeveelheden van het kostbare eiwit in uniforme kristallen nodig zijn om deze hoge straalsnelheden te bereiken en te voorkomen dat het monsterafgiftesysteem wordt geblokkeerd. Grote membraaneiwitten zijn zo moeilijk te isoleren, kristalliseren en leveren aan de straal, dat het niet bekend was of deze belangrijke klasse van eiwitten aan de EuXFEL zou kunnen worden bestudeerd.

Het team ontwikkelde nieuwe methoden waarmee PSI, dat is een groot complex bestaande uit 36 ​​eiwitten en 381 cofactoren, waaronder de 288 chlorofylen (de groene pigmenten die het licht absorberen) en heeft meer dan 150, 000 atomen en is meer dan 20 keer groter dan eerdere eiwitten die zijn bestudeerd aan de EuXFEL, om de structuur ervan bij kamertemperatuur te laten bepalen tot een opmerkelijke resolutie van 2,9 angstrom - een belangrijke mijlpaal.

Miljarden microkristallen van het PSI-membraaneiwit, afgeleid van cyanobacteriën, moest worden gekweekt voor de nieuwe studie. Snelle kristalgroei uit nanokristalzaden was nodig om de essentiële uniformiteit van kristalgrootte en vorm te garanderen. PSI is een membraaneiwit, dat is een klasse van eiwitten van groot belang die notoir lastig te karakteriseren zijn. Hun uitgebreide structuren zijn ingebed in de lipidedubbellaag van het celmembraan. Typisch, ze moeten zorgvuldig worden geïsoleerd in volledig actieve vorm van hun natuurlijke omgeving en worden omgezet in een kristallijne toestand, waar de moleculen zich in kristallen verpakken maar al hun oorspronkelijke functie behouden.

In het geval van PSI, dit wordt bereikt door het te extraheren met zeer milde detergenten die het membraan vervangen en het eiwit omringen als een binnenband van een zwembad, die de natuurlijke membraanomgeving nabootst en PSI volledig functioneel houdt zodra het in de kristallen is verpakt. Dus als onderzoekers licht schijnen op de groene pigmenten (chlorofylen) die het licht opvangen door het antennesysteem van PSI, de energie wordt gebruikt om een ​​elektron over het membraan te schieten.

Om PSI volledig functioneel te houden, de kristallen zijn slechts zwak verpakt en bevatten 78% water, waardoor ze zacht worden als een klontje boter in de zon en het moeilijk maken om deze kwetsbare kristallen te hanteren. "Isoleren, karakteriseren en kristalliseren van één gram PSI, of een miljard miljard PSI-moleculen, voor de experimenten in hun volledig actieve vorm was een enorme inspanning van de studenten en onderzoekers in mijn team", zegt Fromme." In de toekomst, met nog hogere herhalingssnelheden en nieuwe monsterafgiftesystemen zal het monsterverbruik drastisch worden verminderd."

De opname en analyse van de diffractiegegevens was een andere uitdaging. EuXFEL en DESY hebben een unieke röntgendetector ontwikkeld om te voldoen aan de eisen van structurele biologiestudies aan de EuXFEL:de adaptive-gain integrerende pixeldetector, of AGIPD. Elk van de 1 miljoen pixels van AGIPD is minder dan een honderdste van een inch breed en bevat 352 analoge geheugencellen, waarmee de AGIPD gegevens kan verzamelen met megahertz-snelheden over een groot dynamisch bereik. Echter, om nauwkeurige kristallografische gegevens te verzamelen van microkristallen van grote membraaneiwitten, was een compromis nodig tussen ruimtelijke resolutie en bemonstering van de gegevens.

"Het aandringen op het verzamelen van gegevens met een hogere resolutie met de huidige detectorgrootte kan een nuttige verwerking van de kristallografische gegevens uitsluiten omdat de diffractievlekken onvoldoende worden opgelost door de röntgendetectorpixels", waarschuwt Zatsepin, "maar in termen van datasnelheden en dynamisch bereik, waartoe de AGIPD in staat is, is ongelooflijk."

De nieuwe software voor gegevensreductie en kristallografische analyse die speciaal is ontworpen om de uitdagingen aan te gaan die uniek zijn voor de enorme datasets in XFEL-kristallografie, waarvan de ontwikkeling werd geleid door medewerkers van CFEL, DESY, en ASU, hebben een lange weg afgelegd sinds het eerste XFEL-experiment met hoge resolutie in 2011.

"Onze software en DESY's krachtige computercapaciteiten worden echt op de proef gesteld met de ongekende datavolumes die worden gegenereerd bij de EuXFEL. Het is altijd spannend om de grenzen van de nieuwste technologie te verleggen, ", voegt Zatsepin toe.

Membraaneiwitten:floppy, maar toch formidabel

Membraaneiwitten zoals PSI - genoemd omdat ze zijn ingebed in celmembranen - zijn van vitaal belang voor alle levensprocessen, inclusief ademhaling, zenuwfunctie, voedingsopname, en cel-cel signalering. Omdat ze zich aan het oppervlak van elke cel bevinden, zijn ze ook de belangrijkste doelwitten voor farmaceutische geneesmiddelen. Meer dan 60% van alle huidige medicijnen is gericht op membraaneiwitten. Het ontwerp van effectievere medicijnen met minder bijwerkingen is daarom afhankelijk van het begrijpen hoe bepaalde medicijnen binden met hun doeleiwitten en hun zeer gedetailleerde structurele conformaties en dynamische activiteiten.

Ondanks hun enorme belang in de biologie, membraaneiwitstructuren vormen minder dan 1% van alle tot nu toe opgeloste eiwitstructuren omdat ze notoir lastig te isoleren zijn, karakteriseren en kristalliseren. Dit is de reden waarom grote vooruitgang in kristallografische methoden, zoals de komst van membraaneiwit megahertz seriële femtoseconde kristallografie, zullen ongetwijfeld een aanzienlijke impact hebben op de wetenschappelijke gemeenschap.

Er is een dorp voor nodig

Deze recente prestaties zouden niet mogelijk zijn zonder de onvermoeibare inzet van een toegewijd team van bijna 80 onderzoekers van 15 instellingen, inclusief ASU, de Europese XFEL, DESY, het Centrum voor Ultrasnelle X-ray Science, Hauptman-Woodward Instituut, SUNY Buffel, SLAC, Universiteit van Hamburg, Universiteit van Göttingen, Hongaarse Academie van Wetenschappen, Universiteit van Tennessee, Lawrence Livermore Nationaal Laboratorium, Universiteit van Southampton, Technische Universiteit van Hamburg, Universiteit van Wisconsin. De onderzoeksgroep omvatte Amerikaanse medewerkers in het NSF BioXFEL Science and Technology Center en een groep internationale medewerkers, waaronder Adrian P. Mancuso en Romain Letrun, leidende wetenschappers van de EuXFEL-bundellijn en Oleksandr Yefanov en Anton Barty van CFEL/DESY die nauw samenwerkten met het ASU-team aan de complexe data-analyse.