Natuurkundigen van LMU hebben een zeer gevoelige methode ontwikkeld voor het meten van de mechanische stabiliteit van eiwitconformaties, en gebruikte het om de vroege stappen in de vorming van bloedstolsels te volgen.

Als centrale mediatoren van celfunctie in biologische organismen, eiwitten zijn betrokken bij de uitvoering van vrijwel alle cellulaire processen. Ze vormen de interne steiger die cellen hun vorm geeft, en cellen in staat te stellen hun morfologie dynamisch te veranderen. Ze transporteren substraten heen en weer over membranen, en ze katalyseren de meeste chemische reacties die in cellen plaatsvinden. Tijdens deze taken worden veel eiwitten onderworpen aan externe krachten. Inderdaad, sommige "mechanosensitieve" eiwitten meten effectief de sterkte van de krachten die erop inwerken en worden geactiveerd wanneer de opgelegde kracht een bepaalde drempelwaarde overschrijdt. Von Willebrandfactor (VWF), die de vorming van bloedstolsels initieert, is een belangrijke vertegenwoordiger van deze klasse.

De mechanische krachten die nodig zijn om eiwitten zoals VWF te activeren, zijn vaak zo klein dat hun grootte met bestaande methoden niet kon worden bepaald. Nutsvoorzieningen, een team van wetenschappers onder leiding van LMU-fysici Dr. Martin Benoit en professor Jan Lipfert heeft een veel gevoeligere procedure ontwikkeld. Hun "magnetische pincet" kan krachten kwantificeren die 100 keer kleiner zijn dan de veelgebruikte alternatieve methode die momenteel beschikbaar is. Zoals Lipfert en collega's in het tijdschrift rapporteren PNAS , ze hebben de techniek gebruikt om het ontvouwen van het VWF-eiwit onder invloed van lage mechanische krachten te observeren.

Een krachtige benadering om mechanoregulatie te bestuderen is de zogenaamde eiwitkrachtspectroscopie. Dit houdt in dat je aan een individueel eiwitmolecuul trekt en observeert hoe een uitgeoefende kracht zijn driedimensionale structuur verandert. Tot nu toe, de voorkeursmethode voor het trekken was een atoomkrachtmicroscoop, wat het beste werkt in het bereik van 100 piconewton (pN). "Echter, veel moleculaire processen worden geactiveerd door krachten die veel zwakker zijn, " zegt Lipfert. "Dus voor metingen op het niveau van afzonderlijke moleculen, we hebben gevoeligere instrumenten nodig - het heeft weinig zin om een ​​weegschaal te gebruiken om de ingrediënten van een cake af te wegen."

De onderzoekers ontwikkelden een methode waarbij de eiwitten aan het ene uiteinde aan een glazen oppervlak worden bevestigd en aan het andere uiteinde een tag dragen die zich bindt aan kleine magnetische kralen en het samenstel wordt vervolgens onderworpen aan een extern magnetisch veld. Uitbreiding van het eiwit geïnduceerd door het veld resulteert in de verticale verplaatsing van elke kraal, die met microscopie kunnen worden opgespoord. "Dit soort opstelling wordt magnetische pincet genoemd, Lipfert legt uit. "Het heeft het grote voordeel dat het ons in staat stelt zeer zwakke krachten - aanzienlijk minder dan 1 piconewton - op het betreffende eiwit aan te brengen en op te lossen. In aanvulling, magnetische pincetten maken zeer stabiele metingen over lange perioden mogelijk, tot wel een week."

Om de nieuwe methode te testen, de LMU-groep gebruikte VWF als hun doeleiwit. In de bloedbaan, VWF circuleert als een multimeer van dimeren die zijn gemaakt van twee identieke subeenheden. Onder normale omstandigheden van de bloedstroom, het heeft een relatief compacte bolvorm. Echter, elke toename van de schuifkrachten in de bloedbaan als gevolg van beschadiging van het vaatstelsel zorgt ervoor dat vWF zich ontvouwt. Hierdoor worden bindingsplaatsen voor receptoren op bloedplaatjes blootgelegd. Binding van VWF aan bloedplaatjes veroorzaakt op zijn beurt een reactiecascade die leidt tot stolling, die de wond verzegelt. "De cascade wordt veroorzaakt door de actie op het molecuul van mechanische krachten die werken die veel zwakker zijn dan die welke tot nu toe zijn gemeten, ", zegt Lipfert. Analyse van het openritsen van VWF-dimeren met een magnetische pincet toonde aan dat de zogenaamde VWF-steel opengaat onder een uitgeoefende kracht van minder dan 1 pN, wanneer de subeenheden van het dimeer uit elkaar worden getrokken als de twee helften van een ritssluiting. "We nemen aan dat dit gedragspatroon, die we voor het eerst konden waarnemen, vertegenwoordigt de eerste stap in de bloedstolling, " zegt Lipfert. "Onze aanpak geeft een gedetailleerd beeld van de krachten en de veranderingen in extensie die betrokken zijn bij het ontvouwen van het eiwit. We zijn ervan overtuigd dat toekomstige toepassing van de methode zal bijdragen aan een beter begrip van het werkingsmechanisme van VWF en van de rol van klinisch relevante mutaties.