Histologie wordt gebruikt om structurele details van weefsel op microschaal in het pathologielab te identificeren, maar analyses blijven tweedimensionaal (2D) omdat ze beperkt zijn tot hetzelfde vlak. Niet-destructieve 3D-technologieën, waaronder röntgenmicro- en nano-computertomografie (nanoCT), hebben hun geldigheid bewezen om anatomische structuren te begrijpen, omdat ze willekeurige kijkhoeken en structurele 3D-details mogelijk maken. Echter, lage verzwakking van zacht weefsel heeft hun toepassing op het gebied van 3D virtuele histologie belemmerd. In een recente studie, nu gepubliceerd op Wetenschappelijke rapporten , Mark Müller en collega's van de afdeling Natuurkunde en Bio-engineering hebben een op hemateïne gebaseerde röntgenkleuringsmethode ontwikkeld om specifiek celkernen te targeten, gevolgd door demonstraties op een hele leverlobule van een muis.

Het nieuwe kleuringsprotocol combineerde de recent ontwikkelde, nanoCT-systeem met hoge resolutie voor 3D-visualisatie van de weefselarchitectuur op nanometerschaal. De resultaten onthulden de echte 3D-morfologie naast de ruimtelijke verdeling van celkernen. De techniek was ook compatibel met conventionele histologie, aangezien microscopisch kleine objectglaasjes met een monster van zacht weefsel met hetzelfde protocol kunnen worden gekleurd naast aanvullende tegenkleuring. De methode demonstreerde de mogelijkheid voor toekomstige toepassingen in histopathologie, vergezeld van röntgen-CT-apparaten in het laboratorium.

Histologie is de bestaande gouden standaard voor een nauwkeurige microanatomische diagnose in het pathologielab, technieken en resultaten zijn echter beperkt tot 2D. Bijvoorbeeld, een 3D-biopsie wordt meestal onderzocht met behulp van zeer dunne microscopische objectglaasjes (met plakjes van 2-10 µm dik) via conventionele en moderne immunohistochemische en histologische kleuringstechnieken. Micro- en nano-CT zijn krachtige hulpmiddelen die een nauwkeurige reconstructie van weefsel in 3D kunnen bieden. Ontwikkelingen op het gebied van technologie hebben een relatief hoge resolutie mogelijk gemaakt voor bestaande 2D conventionele histologie, met behulp van apparaten variërend van grote deeltjesversnellers tot laboratoriumgebaseerde röntgenapparaten.

Naast de technische vereisten, Röntgen geschikte kleurstoffen (contrastmiddelen) zoals fotowolfraamzuur (PTA), jodium kaliumjodide (IKI), jodium in ethanol (12E), of jodium in methanol (12M) zijn ook belangrijk. De beschikbare kleurstoffen zijn echter momenteel beperkt in omvang en werkzaamheid. Bij het ontwikkelen van medische diagnostiek van de volgende generatie in de histopathologie, wetenschappers streven ernaar de technieken te optimaliseren en weefselarchitectuur te begrijpen van het cellulaire niveau tot de weefselschaal.

Tijdens de eerste diagnose in de klinische pathologie, de celkernen en het cytoplasma zijn van belang. Bijna elk histologisch monster wordt daarom vaak gekleurd via het standaard hematoxyline en eosine (H&E) protocol om de kernen en het cytoplasma te identificeren. Maar standaarden voor de hematoxylinekleuring zijn niet vast en er bestaan ​​veel varianten op het protocol vanwege verschillende weefseltypes en/of parameters voor de voorbehandeling. Als resultaat, Muller et al. introduceerde een hemateïne-gebaseerd kleuringsprotocol, speciaal ontwikkeld voor CT, om directe 3D-visualisatie van celkernen in monsters van zacht weefsel mogelijk te maken. Het krachtige potentieel van microCT of nanoCT in combinatie met kleurstoffen die geschikt zijn voor röntgenstralen, zal toekomstige inzichten in weefselorganisatie mogelijk maken om ziekten, waaronder osteoartritis en kanker, te begrijpen. bij de cellulaire nanoarchitectuur.

Bij het ontwikkelen van de nieuwe X-ray geschikt, hemateïne gebaseerde vlek, de veelgebruikte Mayer's hematoxyline en Wiegert's ijzerhematoxyline werden opgenomen in de grondwet. De kleuringsexperimenten werden uitgevoerd op het weefsel van de leverlobule van de muis, daarna gebruikt voor X-ray CT-beeldvorming. Het geoptimaliseerde kleuringsprotocol bevatte vijf stappen, te beginnen met gecontroleerde verzuring van monsters van zacht weefsel tijdens fixatie. Het zachte weefsel werd op moleculair niveau bereid om te kleuren met het hemateïne-lood(II)-complex.

In zijn werkingsmechanisme, de wetenschappers toonden een versterkte ionische interactie aan tussen het positief geladen hemateïne-lood(II)-complex en de negatief geladen fosfaatruggengraat van het deoxyribonucleïnezuur (DNA). De chemische reactie zorgde voor een hogere accumulatie van de kleurstof in de celkernen door de vorming van een hemateïne-lood(II)-DNA-complex, als een röntgen geschikt middel.

Om de kleuringseffectiviteit te vergelijken, het leverkwabweefsel van de muis werd afgebeeld met microCT vóór kleuring, gevolgd door beeldvorming na hemateïne-protocol gebaseerde kleuring. Het kleuringsproces vond plaats in twee stappen en de gewenste contrastverbetering werd bereikt zoals verwacht na kleuring. De resultaten werden waargenomen met behulp van het microCT-overzicht om verschillende anatomische structuren te laten zien, inclusief het vaatstelsel. De kleuring was homogeen in de gehele leverlobule van de muis, in tegenstelling tot eerdere voorbeelden in grote leverweefselmonsters. Het 3D-beeldvormingsproces maakte toegang tot een reeks CT-plakjes in willekeurige vlakken mogelijk. Verder, in tegenstelling tot conventionele 2D-histologie (met in paraffine ingebed zacht weefsel), het zachte weefsel kan vanuit verschillende hoeken worden bekeken.

Het weefsel werd vervolgens op subcellulair niveau onderzocht met kleinere stukjes van dezelfde leverlobule, die werden ontleed en geanalyseerd met behulp van nanoCT. De gevisualiseerde resultaten toonden regio's van het volume van belang (VOI), celkernen van de hepatocyten en kernen van andere celtypen (Kupffer-cellen en sinusoïdale endotheelcellen). Zwarte hele structuren vertegenwoordigden het galcanaliculaire (BC) netwerk, terwijl de donkerdere grijze waarden het cytoplasma van het leverweefselmonster aangaven. De oriëntatie van het BC-netwerk werd ook waargenomen. Het weefsel werd vervolgens onderzocht met conventionele histologie, met behulp van zeer dunne microscopische objectglaasjes zonder andere kleuring dan de op hemateïne gebaseerde kleuring die is aangebracht. De conventionele techniek bevestigde op dezelfde manier de morfologie van hepatocyten en van andere celtypen (kernen gekleurd in donkerpaars), terwijl het BC-netwerk wit was gekleurd.

De wetenschappers bevestigden de nauwkeurigheid van de 3D-gegevensreconstructie in het onderzoek met eerdere onderzoeken. Toen de op hemateïne gebaseerde procedure opnieuw werd toegepast in conventionele 2D-histologieonderzoeken, de wetenschappers pasten ook een standaard tegenkleuring toe, eosine Y specifiek, naar het celcytoplasma op het weefsel. Bij de resultaten, de celkernen bleven paars terwijl het cytoplasma de roze vlek opnam. Op deze manier, de wetenschappers authenticeerden ook de op kernen gebaseerde, op hemateïne gebaseerde kleuringscapaciteit met standaardhistologie.

Het op hemateïne gebaseerde kleuringsprotocol hielp CT-visualisatie met hoge resolutie voor celkernen in zacht weefsel in het submicronbereik, tot nu toe niet mogelijk met andere kleurmethoden die werden gecombineerd met microCT-technologie. Toekomstige histopathologische onderzoeken kunnen mogelijk tijdrovende voorbereidingsprocedures en verlies van weefselmonsters elimineren (zoals gezien met standaardhistologie) om individuele weefselplakjes te verkrijgen via 3D-onderzoek van een volledige VOI, zoals aangetoond in de huidige studie. De mogelijkheid om een ​​groter monster te screenen op abnormale celkernen zou pathologen kunnen helpen bij het identificeren van ontstekingsregio's om de etiologie en progressie van de ziekte te beoordelen.

Het kleuringsprotocol is eenvoudig en reproduceerbaar, geschikt voor CT-kleuring van hele organen, gekoppeld aan 3D-visualisatie en diepgaande, niet-destructieve analyse van monsters van zacht weefsel. De in het protocol vermelde kleurstoffen zijn gemakkelijk toegankelijk, terwijl het CT-gecombineerde röntgenprotocol een grotere verfijning mogelijk maakt voor analyses van weke delen. Stappen in het kleuringsprotocol vereisen verdere optimalisatie met verschillende weefseltypes en in diverse toepassingen, inclusief 3D histologie, ontwikkelings- en structurele biologiestudies in het laboratorium.

© 2018 Wetenschap X Netwerk