Wetenschappers zijn geïnteresseerd in de ruimtelijke structuur van eiwitten om meer te weten te komen over de werking van deze biomoleculen. Deze kennis kan leiden tot een beter begrip van de functies van biomoleculen en tot medicijnen op maat. Röntgenkristallografie is het belangrijkste hulpmiddel om eiwitstructuren op te lossen. Echter, het vereist groeiende kristallen van de onderzochte eiwitten. Wanneer röntgenstralen deze kristallen raken, ze worden van de atomen afgebogen om een ​​karakteristiek patroon te vormen waaruit de ruimtelijke structuur van het kristal - en dus de eiwitmoleculen - kan worden berekend.

Echter, veel eiwitten houden er niet van om in kristallen te worden geperst, omdat het in tegenspraak is met hun natuurlijke staat. "Het kweken van eiwitkristallen is complex. De hoeveelheid eiwit die kan worden geproduceerd, is vaak beperkt tot enkele miljoensten van een gram, en vaak, alleen zeer kleine kristallen kunnen worden verkregen, " zegt Dominik Oberthür van DESY, hoofdauteur van het rapport. Met de extreem heldere flitsen van röntgenvrije-elektronenlasers, zelfs die microkristallen kunnen worden geanalyseerd, maar meestal zijn er duizenden diffractiepatronen nodig om de eiwitstructuur op te lossen. Omdat de delicate microkristallen volledig verdampen door de intense röntgenflits nadat ze hun diffractiepatroon hebben afgegeven, een stroom verse microkristallen wordt door de laserstraal gestuurd. Dit concept staat bekend als seriële röntgenkristallografie, en heeft de analyse van veel voorheen ontoegankelijke eiwitten mogelijk gemaakt.

Nog altijd, zelfs die microkristallen zijn moeilijk te verkrijgen, en slechts een fractie wordt daadwerkelijk geraakt door de röntgenflits, afhankelijk van de geometrie van de kristalstroom en de technische parameters van de röntgenlaser. "Hoe minder kristallen, hoe minder eiwit je nodig hebt, des te beter is de analyse, ", zegt Oberthür. Het team van Bajt bedacht een nieuw concept voor een zogenaamde double flow-focusing nozzle (DFFN) die de consumptie van eiwitkristallen aanzienlijk vermindert. de eiwitkristallen worden met behulp van een speciaal mondstuk met wat dragervloeistofbuffer in de röntgenstraal geïnjecteerd. Om een ​​dunne straal te vormen, de dragervloeistof wordt versneld door een snelle gasstroom die de vloeistof omringt. Maar om een ​​stabiele straal te vormen, een minimaal debiet nodig is, meestal verspillen de meeste kristallen in de jet.

Om deze moeilijkheden te overwinnen, het team voegde ethanol toe als een secundaire "omhulsel" -vloeistof tussen het gas en de buffer. Dit leidt ertoe dat de mantelvloeistof wordt versneld door het gas. De kristallen in hun buffer kunnen dan als een zeer dunne stroom in het midden van de ethanolstraal worden geïnjecteerd. "Voordat, de buffer met de kristallen moest twee taken vervullen:een stabiele straal vormen en eiwitkristallen vervoeren, " legde Juraj Knoška uit, een doctoraat student aan CFEL en de Universiteit van Hamburg, die de sproeiers heeft ontwikkeld. "Onze aanpak scheidt deze rollen en gebruikt de vloeistoffen die het beste zijn voor de klus." Ethanol heeft ideale eigenschappen om een ​​zeer stabiele straal te vormen, die stroomt met slechts een fijne stroom van de kristaldragende buffer in het midden. Op deze manier, het debiet van de buffer kon worden teruggebracht van ongeveer 40 microliter (miljoensten van een liter) tot slechts twee microliter per minuut. Ook, de boete, stabiele stroom nanokristallen kan precies overlappend worden gehouden met de kleine straal van de röntgenlaser. Bovendien verbetert de vermindering van de totale stroomsnelheid de kwaliteit van de diffractiepatronen en de snelheid waarmee kristallen daadwerkelijk door de röntgenflitsen worden geraakt.

"We verminderen niet alleen het kristalverbruik, maar ons mondstuk met dubbele stroomfocus maakt het gebruik van de röntgenbron ook efficiënter door de snelheid te verhogen waarmee we hoogwaardige diffractiepatronen verzamelen, " zegt Bajt. "Bovendien, met behulp van de omhulselvloeistof kunnen we eiwitten onderzoeken in buffers die voorheen niet konden worden geïnjecteerd. Ons concept verbreedt het spectrum van biomoleculen die kunnen worden geanalyseerd." Haar team testte het nieuwe mondstuk bij de röntgenlaser LCLS van het SLAC National Accelerator Laboratory in de VS. De wetenschappers werkten samen met verschillende groepen om de structuren van verschillende eiwitten op te lossen .

"Samen met de groep van Nobelprijswinnaar Roger Kornberg van Stanford University, konden we voor het eerst de structuur van het enzym RNA-polymerase II bij kamertemperatuur oplossen, ", legt Oberthür uit. "Omdat kristallografie bij kamertemperatuur een voorwaarde is om structurele dynamiek in detail te bestuderen, dit opent de deur voor toekomstige tijdsopgeloste studies of 'moleculaire films' met dit belangrijke systeem." Het nieuwe apparaat werd ook gebruikt om twee andere enzymen te analyseren, een membraangebonden hydrogenase en een dioxygenase, evenals natuurlijk voorkomende eiwit nanokristallen, uit de beschermende cocon van een gespecialiseerd virus (Cydia pomonella granulovirus, CpGV).

De dubbele stroom-focussing nozzle rekent ook af met een ander praktisch probleem van deze vorm van straalinjectie:aan de rand van conventionele sproeiers, buffermateriaal, eiwit- en waterijskristallen aggregeren in de loop van de tijd om druipsteenachtige kenmerken te vormen. Hetzelfde gebeurt vaak op de bodem van de opvangbak onder het mondstuk. Als deze eiwit-ijs-stalactieten en stalagmieten in de röntgenstraal groeien, ze maken het diffractiepatroon niet alleen onbruikbaar, hun reflecties kunnen zo sterk zijn dat ze de detector vernietigen. Dus, zo nu en dan, experimenten moeten worden opgeschort om de druipstenen van eiwit-ijs te verwijderen. "De omhullende vloeistof in ons mondstuk voorkomt de vorming van dergelijke ongewenste structuren. Het dubbele stroom-focusserende mondstuk zorgde voor stabiele experimentele omstandigheden gedurende vele uren, ", legt Oberthür uit.

"In alle experimenten werkte het mondstuk buitengewoon goed, " vat Bajt samen. "We zouden het aantal onderbrekingen in een dienst kunnen verminderen van tien naar nul, en we verwachten dat experimentele stations bij andere röntgenlasers en bij synchrotron-lichtbronnen zoals DESY's PETRA III ook kunnen profiteren van de voordelen van ons apparaat."