Optisch onderzoek en manipulaties vormen vaak de kern van biologische experimenten. In een nieuw rapport dat nu is gepubliceerd in wetenschappelijke vooruitgang , Kazuki Okamato en een team van wetenschappers in de farmaceutische wetenschappen, neurowetenschap, medicijn, natuurkunde en kunstmatige intelligentie aan de Universiteit van Tokio, Japan, introduceerde een nieuw materiaal van borosilicaatglas dat een zeldzame-aarde-ion terbium (III) (Tb .) bevat ³⁺ ). Het materiaal straalde groene fluorescentie uit bij excitatie met blauw licht, net als groen fluorescerend eiwit (GFP) met brede compatibiliteit in biologische onderzoeksomgevingen. Met behulp van micropipetten gemaakt van met terbium gedoteerd glas, Okamato et al. gerichte GFP-gelabelde cellen voor eencellige elektroporatie, eencellige transcriptoomanalyse en patch-clamp-opname-experimenten onder realtime fluorescentiemicroscopische controle. Het glas vertoonde ook potentiële derde harmonische generatie bij infrarood laserexcitatie, nuttig voor online optische targeting van fluorescent gelabelde neuronen in de neocortex in vivo. Op deze manier, het met terbium gedoteerde glas vereenvoudigde meerdere procedures in biologische experimenten met bredere toepassingen in biomedisch onderzoek.

Optisch onderzoek in vivo uitvoeren

Optisch onderzoek en celmanipulaties in levende weefsels zijn wijdverbreid in biologisch onderzoek met de capaciteit om verschillende eigenschappen in cellen en tijdens intracellulaire communicatie te onthullen. Hoewel genetische labeling de identificatie mogelijk heeft gemaakt van cellen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, blijft het moeilijk om fluorescent gelabelde cellen te bereiken met behulp van glazen pipetten, aangezien glas niet fluorescerend is in het zichtbare bereik. Om deze technische problemen op te lossen, Okamato et al. introduceerde een nieuwe samenstelling van borosilicaatglas. De zeldzame-aarde-ionen vertoonden een unieke fluorescentie-emissie met scherpe pieken in het zichtbare lichtspectrum. Het team richtte zich op terbium (III) (Tb ³⁺ ), die complexe energieniveaustructuren hebben en waarvan theoretisch wordt verwacht dat ze groene fluorescentie uitstralen. De excitatiegolflengte was in de buurt van de hoogste zichtbaarheid voor menselijke ogen en dicht bij die van groen fluorescerend eiwit. Als resultaat, pipetten gemaakt van met terbium gedoteerde glazen waren nuttig voor op fluorescentie gerichte, eencellige manipulatie in de biowetenschappen.

Het team ontwikkelde het borosilicaatglas met 3,1 mol% (mol%) terbiumoxide (Tb .) ₂ O ₃ ). Het terbium (Tb ³⁺ )-gedoteerd glas straalde groene fluorescentie uit die met het blote oog zichtbaar is, zelfs onder kamerlicht. de Tb ³⁺ - gedoteerd glas had een absorptiepiek bij een golflengte van 484 nm, wat niet werd waargenomen in normaal borosilicaatglas zonder terbium. De wetenschappers produceerden glazen capillairen en pipetten waar het gevormde glas groene fluorescentie bleef uitstralen. Met behulp van scanning elektronenmicroscopie, het team controleerde de pipettips op eventuele afwijkingen die de kwaliteit van elektrofysiologische opnames zouden kunnen beïnvloeden. Okamato et al. gebruikten vervolgens de nieuwe micropipetten om eencellige elektroporatie van een rood fluorescerend eiwit (tdTomato) in neuronen uit te voeren in organotypische hippocampale plakstructuren van ratten. Ze bekeken de pipetten met de rode kleurstofvector en piramidale cellen die minimaal waren gelabeld met verbeterde GFP, met hetzelfde optische apparaat. De wetenschappers bevestigden de pipetpunten aan de cellen en pasten elektrische pulsen toe voor elektroporatie om de expressie van de rode kleurstof na 48 uur te vergemakkelijken. Daarna, het team voerde eencellige RNA-sequencing uit met de pipetten in acute plakjes van de primaire motorcortex van de muis van transgene muizen.

De nieuwe micropipetten gebruiken voor in vitro patchklemopnames

De onderzoekers voerden vervolgens patch-clamp-opnames uit van primaire culturen van hippocampale neuronen die dun waren gelabeld met GFP met behulp van een met terbium gedoteerde pipet geladen met een rode fluorescerende kleurstof (Alexa Fluor 594). De pipetten vulden met succes de doelcellen met de kleurstof en hielden ze in de configuratie met hele cellen. Het team paste dezelfde methode toe op acute hersenplakpreparaten waarbij neuronen zich dieper in minder transparante weefsels bevonden dan gekweekte neuronen. Toen Okamato et al. gepatchte piramidale cellen in de acute hippocampale plakjes met behulp van terbium-gedoteerde pipetten, de neuronen vertoonden normale actiepotentialen als reactie op korte stroominjecties. De cellen vertoonden normale spontane prikkelende en remmende postsynaptische stromen onder de spanningsklemconfiguratie. De micropipetten konden worden gebruikt voor langdurige stabiele opnames en waren ook nuttig voor opnames van neurieten. Het team registreerde backpropagerende actiepotentialen met behulp van de opstelling van gerichte dendrieten.

In vivo patch-clamp-opnames met behulp van de met terbium gedoteerde pipetten

Okamato et al. next characterized the nonlinear multiphoton excitation of terbium-doped glass using infrared light at wavelengths that were approximately double the single-photon excitation peak (484 nm) of terbium. Using a photomultiplier tube through a 495-to-540 nm band-pass filter, the team captured the green fluorescence emitted by terbium-doped pipettes. The emissions peaked at an excitation wavelength of 975 nm, suggesting that a laser wavelength corresponding to the value excited the glass through a two-photon absorption process. The scientists also noted another bright signal at 1300 nm excitation through a 410-to-450 band pass filter and suggested the signal to have likely arisen from third harmonic generation (THG). Based on the strong THG signal of the micropipettes, Okamato et al. conducted in vivo whole cell patch-clamp recordings with a multiphoton laser microscope. They simultaneously used the cells and terbium-doped pipette using dual-laser irradiation at 1, 040 nm and 1, 300 nm, respectievelijk, and recorded the injection-induced action potentials and spontaneous membrane fluctuations under the current-clamp configuration.

Op deze manier, Kazuki Okamato and colleagues invented a terbium-doped glass emitting green fluorescence signal strong enough to be visible to the naked eye. The material had similar characteristics to conventional borosilicate glass and did not display photobleaching or cytotoxicity. The new micropipettes allowed fluorescence manipulations such as optical targeting of single-cell electroporation, single-cell RNA sequencing and electrophysiological recordings. The glass also emitted third harmonic generation upon three-photon excitation, applicable for in vivo manipulation. The terbium-doped glass therefore provided a platform for multiple purposes in biomedical research including hitherto conventional patch-clamp recordings to open new frontiers in life sciences.

© 2021 Science X Network