Een onderzoeksteam onder leiding van de Kobe University heeft het mechanisme belicht waarmee cyanobacteriën (Synechocystis sp. PCC 6803) D-lactaat produceren, waaruit blijkt dat appelzuur deze productie vergemakkelijkt. Vervolgens, ze zijn erin geslaagd om 's werelds hoogste gehalte (26,6 g/L) D-lactaat rechtstreeks uit CO . te produceren ₂ en licht door de D-lactaatsyntheseroute te wijzigen met behulp van genetische manipulatie.

Verwacht wordt dat dit succes zal bijdragen aan de ontwikkeling van belangrijke procestechnologieën voor de productie van polymelkzuur, dat wordt gebruikt om biologisch afbreekbare kunststoffen te maken. Dit zou kunnen helpen om het concept van een duurzame, koolstofarme samenleving een realiteit.

De onderzoeksgroep bestond uit professor HASUNUMA Tomohisa (van het Engineering Biology Research Center van Kobe University), Project Associate Professor HIDESE Ryota (van de Graduate School of Science van Kobe University, technologie en innovatie) en universitair hoofddocent OSANAI Takashi (van de Landbouwschool van Meiji University).

De resultaten van dit onderzoek zijn online gepubliceerd in het internationale wetenschappelijke tijdschrift ACS synthetische biologie op 31 januari 2020.

Het gebruik van bioproductie om veelzijdige chemische verbindingen en functionele grondstoffen te synthetiseren die meestal uit olie worden gewonnen, is van vitaal belang voor zowel het milieu als de duurzaamheid van hulpbronnen. In recente jaren, bioproductiemethoden met behulp van microben hebben aandacht gekregen. Onder deze microben zijn microalgen. Met behulp van zonlicht en CO . kunnen verschillende nuttige stoffen zoals oliën en pigmenten uit microalgen worden gemaakt ₂ .

Cyanobacteriën is een soort snelgroeiende microalgen die gemakkelijk genetisch te modificeren is. Cyanobacteriën zijn eerder gebruikt om D-lactaat te produceren, de lage opbrengst is echter een obstakel geweest dat de praktische toepassing van deze methoden verhindert.

Cyanobacteriën worden CO ₂ via fotosynthese in het suikerglycogeen terecht. Als cyanobacteriën die glycogeen in hun cellen hebben opgehoopt, in een donkere omgeving zonder zuurstof worden geplaatst, het glycogeen wordt gemetaboliseerd door de cyanobacteriën en het scheidt organische zuren (zoals barnsteenzuur en melkzuur) af in het groeimedium.

Om D-lactaat uit cyanobacteriën te synthetiseren, er moet een toename van de pyruvaatproductie zijn. Deze onderzoeksgroep ontdekte dat het appelenzym, dat appelzuur omzet in pyruvaat, is essentieel voor de productie van D-lactaat. Ze gebruikten dynamische metabolomics om het mechanisme achter de productie van D-lactaat te belichten. Door deze analyse, ontdekten ze dat wanneer overmatig appelzuur in de cellen wordt geproduceerd, niet alleen wordt appelzuur omgezet in pyruvaat, maar ook de route om pyruvaat uit glycogeen te produceren wordt geactiveerd (Figuur 1). D-lactaat wordt gebiosynthetiseerd uit pyruvaat door D-lactaatdehydrogenase. De onderzoeksgroep slaagde erin 26,6 g/L D-lactaat te produceren met een conversieratio van 94,3% uit het geaccumuleerde glycogeen door het D-lactaatdehydrogenase genetisch te manipuleren om zijn functie te optimaliseren (Figuur 2).

Dit onderzoek betekent een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van een industrieel proces om D-lactaat te produceren uit CO ₂ . De groep wil de productie van D-lactaat blijven stimuleren door middel van optimalisatie van de stofwisselingsroutes en analyse van teeltomstandigheden.

Er is een grote markt voor D-lactaat, die kan worden gebruikt als grondstof in de productie stereocomplex PLA dat een biologisch afbreekbare kunststof is. Anderzijds, hoge zuiverheid en productiviteit zijn vereist om biologisch synthetiserend D-lactaat met microben levensvatbaar te maken. Er bestaan ​​bioproductiemethodologieën die heterotrofe microben zoals E. coli gebruiken, deze gebruiken echter suiker (glucose) uit maïs of suikerriet als energiebron voor de productie. Dit betekent dat het kweken van deze planten voor bioproductie een groot aantal problemen veroorzaakt, zoals concurrentie met voedselbronnen, gebruik van bouwland en zoetwaterbronnen, en bijdrage aan de vernietiging van het milieu (bijvoorbeeld ontbossing).

cyanobacteriën, anderzijds, is een ideale microbe voor het produceren van nuttige stoffen, omdat het CO . kan omzetten ₂ gefixeerd via fotosynthese in verschillende doelverbindingen. In aanvulling, cyanobacteriën hebben een veel hoger fotosynthetiserend vermogen dan planten, wat betekent dat het zelfs onder sterk licht kan worden gekweekt. Het heeft geen grond nodig en veel soorten kunnen in zeewater worden gekweekt. Daarom is het te hopen dat cyanobacteriën de ultieme basis kunnen vormen voor bioproductie, aangezien het alleen zonlicht nodig heeft, CO ₂ en zeewater.

Het is algemeen bekend dat cyanobacteriën een manier kunnen zijn om D-lactaat te synthetiseren, en er zijn pogingen gedaan om de productie van D-lactaat te stimuleren met behulp van genetische modificatie. Echter, bijna alle systemen die D-lactaat produceren, zijn verbonden met vermeerdering via fotosynthese, zodat kleine hoeveelheden van deze doelstof worden gesynthetiseerd. De reden hiervoor is dat het mechanisme voor de productie van D-lactaat in cyanobacteriën niet goed is begrepen.

Metaboloomanalysetechnieken stellen onderzoekers in staat om de veelheid aan verbindingen die in cellen worden aangetroffen, zowel te identificeren als te berekenen. Deze onderzoeksgroep ontwikkelde 'Dynamic Metabolomics' waarmee ze de hoeveelheid stoffen die in de loop van de tijd worden gemetaboliseerd, konden observeren.

De Synechocystis sp. PCC 6803 cyanobacteriën die in deze studie zijn gebruikt, is een van de meest onderzochte cyanobacteriën ter wereld. Het is een modelorganisme voor de productie van fotosynthese omdat het gemakkelijk genetisch te wijzigen is en snel groeit. Eerder onderzoek van deze groep met dynamische metabolomics toonde aan dat barnsteenzuur voornamelijk wordt geproduceerd via appelzuur in Synechocystis sp. PCC 6803. De huidige studie richtte zich op appelenzym, die appelzuur omzet in pyruvaat. Eerst, ze waren gericht op het ophelderen van de effecten van appelzuurenzym op het metabolisme van Synechocystis sp. PCC 6803 via dynamische metabolomics. Hun volgende doel was om de D-lactaatproductie te verhogen met behulp van metabolic engineering.

onderzoeksmethode

Om het mechanisme achter de productie van D-lactaat uitgebreid te onderzoeken, werden twee celtypes gecreëerd:1. Cellen die geen appelenzymfunctie hadden en 2. Cellen waarin deze functie werd geoptimaliseerd, wat leidt tot een overexpressie van het appelenzym.

Dynamische metabolomics werd gebruikt om het verschil in het metabolisme tussen deze twee cellen te analyseren. Het bleek dat er meer pyruvaat uit glycogeen werd geproduceerd wanneer het appelzuurgehalte in de cellen laag was (Figuur 1).

De onderzoeksgroep verder genetisch gemodificeerde malic enzym geoptimaliseerde cellen om D-lactaat dehydrogenase tot overexpressie te brengen, en versterkte de functie van het D-lactaatdehydrogenase om D-lactaat uit pyruvaat te produceren. In aanvulling, de groep heeft de cellen genetisch gemanipuleerd om het enzym acetaatkinase te verwijderen om de productie van bijproductzuren te onderdrukken.

De gemodificeerde Synechocystis sp. PCC 6803 werd vervolgens gekweekt in een donkere anoxische omgeving (fermentatieomstandigheden). Onder deze voorwaarden, de cellen bereikten de optimale dichtheid. Deze onderzoeksgroep overtrof de vorige hoogste opbrengst aan D-lactaat (10,7 g/L) ter wereld ruimschoots. door 26,6 g/L te produceren met een snelheid van 0,185 g/L/u (Figuur 2). Er wordt gedacht dat deze bevinding kan bijdragen aan een goedkoop proces om hoge niveaus van D-lactaat te produceren.

Verder onderzoek

Cyanobacteriën kunnen worden gebruikt om veel veelzijdige chemische verbindingen en functionele grondstoffen te produceren, deze technologie is echter nog niet ver genoeg ontwikkeld om op industriële schaal te worden geïmplementeerd. Het grote probleem is dat lagere niveaus van de doelverbinding worden geproduceerd met behulp van cyanobacteriën, vergeleken met de hoeveelheden die worden geproduceerd bij gebruik van heterotrofe micro-organismen. Het huidige onderzoek heeft aangetoond dat de dynamische metabolomics-analyse zeer effectief is voor het evalueren van de functie van Synechocystis. Op basis van het resultaat van de dynamische metabolomics, deze groep stelde de Synechocystis in staat om optimaal te presteren door hun metabolisme genetisch te wijzigen.

Gehoopt wordt dat het verhogen van de fotosynthetische productiviteit van cyanobacteriën door dynamische metabolomics en metabolic engineering kan bijdragen aan de realisatie van een duurzame, koolstofarme samenleving.