Een team uit Kaapstad heeft onlangs het eerste hoge resolutie cryo-elektronenmicroscopie (EM) papier gepubliceerd dat afkomstig is uit Afrika. Zoals beschreven in Natuur Communicatie Biologie , het team loste de structuur van een nitrilasen-enzym op tot een bijna atomaire resolutie en gebruikte de structurele inzichten om een ​​gemuteerd enzym te ontwerpen dat kan worden verfijnd voor toepassingen in de biotechnologie. Dit werk is mogelijk gemaakt door een toegangsprogramma dat wordt gefinancierd door het Synchrotron Techniques for African Research and Technology-project, een gezamenlijke subsidie ​​die tot doel heeft partnerschappen op te bouwen tussen toonaangevende wetenschappers in Afrika en het VK die samenwerken aan onderzoek met behulp van synchrotron-wetenschap.

Nitrilasen zijn een fascinerende klasse van plantenenzymen die belangrijke spelers zijn bij de synthese van een breed scala aan belangrijke chemicaliën. Deze enzymen hebben typisch specificiteit voor een klein aantal substraten, toch hebben ze een enorm biotechnologisch potentieel. Een team van wetenschappers van de Universiteit van Kaapstad wilde dit potentieel realiseren door de structuur van de enzymen te onderzoeken met behulp van cryo-EM in het elektronen Bio-imaging Center (eBIC).

Na het succesvol verkrijgen van hoogwaardige structurele informatie, het team verkreeg een beeld met een bijna atomaire resolutie (3,4 ) van een nitrilase afgeleid van de koolfamilie. Met behulp van deze structuur, het team ontwierp semi-rationeel een nieuw gemuteerd nitrilase dat inwerkte op substraten die niet werden gekatalyseerd door andere natuurlijk voorkomende nitrilasen.

Het team hoopt dat ze door kunnen gaan met het maken van 'designer' nitrilasen voor elk substraat dat de industrie nodig heeft - of het nu gaat om farmaceutische, fijne chemicaliën of zelfs voedsel. Er is meer werk aan de eBIC gepland om deze vruchtbare studie voort te zetten.

Spiraalvormige wendingen

Nitrilasen zijn een klasse enzymen die worden gebruikt om carbonzuren te produceren, ammoniak en amiden voor de grootschalige synthese van medicijnen en industrieel belangrijke chemicaliën. Een team van wetenschappers van de Universiteit van Kaapstad was gefascineerd door deze enzymen en wilde bestuderen hoe ze evolueerden en hun structuur en functie correleren.

De groep vergeleek aanvankelijk twee verschillende nitrilasen van Arabidopsis thaliana (een lid van de koolfamilie) en zag dat men een breed scala aan substraten had, maar de andere was veel specifieker voor slechts een klein aantal substraten. Ze voerden een reeks mutaties uit in de bindingsholte van de enzymen en ontdekten dat het wisselen van een enkel aminozuur de substraatvoorkeur van de nitrilasen veranderde. Met deze prikkelende kennis, de groep besloot gedetailleerde structurele informatie te verkrijgen om te onthullen hoe nitrilasen hun substraten kiezen.

Dr. Jeremy Woodward, Docent medische biochemie aan de Universiteit van Kaapstad en hoofdonderzoeker van de studie legde de motivaties van zijn groep uit,

"Om te proberen te achterhalen wat er aan de hand was, hebben we alle enzymen in beeld gebracht met behulp van cryo-EM met lage resolutie aan de Universiteit van Kaapstad en ontdekten dat ze filamenten vormden, en dat de strakheid van hun spiraalvormige draaiing gecorreleerd was met de substraatgrootte. In feite, het aminozuur dat we ontdekten, bevond zich op een grensvlak tussen twee helixvormige subeenheden. We hebben deze correlatie waargenomen met een groot aantal nitrilase-enzymen, maar kon niet verklaren wat er op moleculair niveau gebeurde tot ons recente bezoek aan eBIC bij Diamond Light Source."

Dichtbij atomaire structuur

Het team had eerder negatieve kleuring elektronenmicroscopie (EM) gebruikt die beperkt is tot een resolutie van 20 Å, en is niet hoog genoeg om atomaire details in de structuur te zien. Aanvullend, eerder werk van andere laboratoria had aangetoond dat nitrilasen niet kunnen worden gekristalliseerd, dus cryo-EM was hun enige optie.

"Dit was de enige methode die kon worden gebruikt om de vragen die ze hadden te beantwoorden, " verklaarde Dr. Adriana Klyszejko, postdoctoraal onderzoeker bij de eBIC die assisteerde bij het onderzoek. "Bij Diamant, wat we hebben gecreëerd, is een geïntegreerde inspanning voor onze gebruikersgemeenschap, waar ze hun onderzoek verder kunnen stimuleren."

Bij de eBIC, het team kreeg een structuur met een resolutie van 3,4 Å. Dr. Woodward, uitgewerkt:

"De hoge kwaliteit van de verkregen gegevens stelde ons in staat om voor het eerst de structuur van een intacte nitrilase spiraalvormig filament te visualiseren met een resolutie die bijna atomair was. We observeerden een lus, op zijn plaats gehouden door het aminozuur dat we ontdekten, dat beperkt de maximale grootte van gebonden substraten en verschuift met spiraalvormige twist."

De START-beurs

Het werk is mogelijk gemaakt met een Synchrotron Techniques for African Research and Technology (START) subsidie; een initiatief opgezet in maart 2019 om partnerschappen op te bouwen tussen wetenschappers in Afrika en het VK. START wordt gefinancierd door een subsidie ​​van £ 3,7 miljoen van de UKRI's Science and Technology Facilities Council (STFC) van het Global Challenges Research Fund (GCRF). De STFC kende de financiering van de GCRF toe, een 5-jarig fonds van £1,5 miljard dat een sleutelcomponent is in de uitvoering van de Britse hulpstrategie, ervoor te zorgen dat Brits onderzoek een leidende rol speelt bij het aanpakken van de problemen waarmee ontwikkelingslanden worden geconfronteerd door middel van onderzoek en innovatie.

De motivatie voor START komt voort uit de maatschappelijke uitdagingen waarmee Afrikaanse gemeenschappen worden geconfronteerd; bijvoorbeeld, 600 miljoen mensen (70%) in Afrika bezuiden de Sahara leven zonder elektriciteit, en een betrouwbare elektriciteitsvoorziening is een van de krachtigste instrumenten om mensen uit de armoede te halen en hun afhankelijkheid van hulp te beëindigen. START-onderzoekers gaan energiematerialen onderzoeken, inclusief zonnecelstructuren, katalysatoren en batterijen. De ontwikkeling van de gezondheidszorg in Afrika wordt belemmerd door een gebrek aan fundamenteel begrip van de oorzaak van ziekten als malaria of hiv. Structurele biologie geeft ongekend inzicht in de mechanismen achter dergelijke ziekten.

Naast het verlenen van toegang tot de faciliteiten van wereldklasse op de eBIC aan de wetenschappers uit Zuid-Afrika, de beurs ondersteunde ook postdoctorale wetenschappers, Dr. Andani Mulelu, de hoofdonderzoeker van het onderzoek. "Dit werk zou niet mogelijk zijn geweest zonder dit, omdat de apparatuur, ondersteuning en infrastructuur die nodig is om dit experiment met succes uit te voeren, is niet beschikbaar in Afrika, " legde Dr. Woodward uit.

Dr. Gwyndaf Evans, Hoofdbundellijnwetenschapper op Diamond's VMXm-bundellijn, en Life Sciences Principal Investigator voor het START-project commentaar:

"Het START-initiatief heeft tot doel, onder andere, om te helpen bij het opbouwen van expertise en capaciteit voor structurele biologie in Afrika. In eerste instantie leggen we de nadruk op het vergemakkelijken van de toegang tot de structurele biologiefaciliteiten van Diamond door middel van gerichte trainingen in Zuid-Afrika en lokaal hier bij Diamond. Het uiteindelijke doel is om Afrikaanse financieringsinstanties de kracht en voordelen van structurele biologie te demonstreren bij het aanpakken van Afrikaanse problemen in de menselijke gezondheid en landbouw om structurele biologie tot een duurzame activiteit op het continent te maken. Het zien van experts zoals Jeremy Woodward die een vaste aanstelling in Zuid-Afrika krijgen, is een goed voorteken voor de toekomst en draagt ​​enigszins bij aan het opbouwen van deze duurzaamheid."

Designer nitrilasen

Met behulp van de inzichten die zijn verkregen uit de cryo-EM-structuur met hoge resolutie, het team vertoonde meer dan 5, 000 mutanten om een ​​nieuw enzym te ontwerpen met een gewijzigde spiraalvormige draai die inwerkt op een nieuwe set substraten die niet worden gekatalyseerd door andere plantaardige nitrilasen. Dit werd uitgevoerd door 'hotspot'-aminozuren te identificeren voor gerichte evolutie en ze te selecteren door de overleving van bacteriën te koppelen aan de succesvolle conversie van een bibliotheek van substraten.

Voortbouwend op dit werk, het team hoopt nitrilasen te finetunen om hun volledige biotechnologische potentieel te realiseren. "We willen het punt bereiken waarop we 'designer' nitrilasen voor elk substraat kunnen produceren door de juiste veranderingen aan te brengen in de spiraalvormige twist en de bindingszak. Om dit te bereiken, we willen een verzameling belangrijke nitrilasen visualiseren met een reeks verschillende helixtoestanden (en substraatspecificiteiten) door cryo-EM met hoge resolutie, " concludeerde prof. Woodward.