Mineralisatie wordt gemedieerd door osteoblasten, die minerale voorlopers afscheiden via matrixblaasjes (MV's) als een fundamenteel proces bij gewervelde dieren. De blaasjes zijn rijk aan calcium en fosfaat, met organische materialen zoals zure eiwitten. In een nieuwe studie die nu is gepubliceerd in wetenschappelijke vooruitgang , Tomoaki Iwayama en collega's van de afdelingen parodontologie, biomedisch onderzoek, orale wetenschap, Bij de ontwikkeling van biomaterialen en orale anatomie werd gebruik gemaakt van scanning-elektronenondersteunde diëlektrische microscopie (SE-ADM) en superresolutiemicroscopie (SRM) om levende osteoblasten te beoordelen tijdens mineralisatiecondities met een resolutie op nanoniveau. Ze ontdekten dat de calciumbevattende blaasjes multi-vesiculaire lichamen zijn die mineraliserende nanoblaasjes of matrixblaasjes (MV's) bevatten. Volgens de waarnemingen de MV's kunnen samen met lysosomen worden getransporteerd en worden uitgescheiden door exocytose. Iwayama et al. gepresenteerd bewijs dat de lysosomen amorf calciumfosfaat kunnen transporteren in mineraliserende osteoblastcellen.

Tijdens het fysiologische proces van botmineralisatie, de afzetting van calciumfosfaatkristallen vindt plaats in de extracellulaire matrix als een fundamenteel proces bij alle gewervelde dieren. In 1967, biologen Clarke Anderson en Ermanno Bonucci, individueel gevisualiseerde mineraalgerelateerde deeltjes in de extracellulaire ruimte met behulp van elektronenmicroscopie (EM). Wetenschappers herkenden deze deeltjes later als mineraliserende nanoblaasjes of matrixblaasjes (MV's). Tijdens de afgelopen 50 jaar van EM-onderzoeken naar MV's, biologen hebben geworsteld om het mechanisme van MV-vorming en -afscheiding te begrijpen, die grotendeels onbekend blijft.

Het verduidelijken van het mineralisatieproces van levende cellen met EM is een uitdaging, aangezien de monstervoorbereiding voor EM stappen vereist voor zowel chemische fixatie als alcoholische uitdroging. De stappen kunnen artefacten veroorzaken en zelfs onstabiele minerale voorlopers oplossen of verwijderen, waardoor een organische steiger achterblijft die bekend staat als een "kristalgeest". Terwijl wetenschappers met succes het proces van EM hadden gebruikt met behulp van gefixeerd en gedehydrateerd weefsel om de structuur van gemineraliseerde collageenfibrillen in bot te bekijken, om minerale voorlopers te bestuderen, ze moeten cryo-EM-processen gebruiken om uitdroging te voorkomen en dure, extreem snelle afkoeling met kleine exemplaren.

Om deze beperkingen in het huidige werk te overwinnen, Iwayama et al. gebruikte een nieuw microscopisch systeem dat bekend staat als scanning electron-assisted diëlektrische microscopie (SE-ADM). De methode had eerder een resolutie op nanoschaal en beeldvorming met hoog contrast bereikt voor zoogdiercellen in waterige media zonder kleuring. De wetenschappers gebruikten dezelfde techniek (hoge resolutie SE-ADM) om de mogelijkheid te onderzoeken om MV's in intacte osteoblasten te bekijken om de biogenese van MV-handel te begrijpen. Voor de osteoblastcellijn gebruikten ze murine (muis) osteoblastische cellijn KUSA-A1, met hoge osteogene capaciteit in vitro en in vivo. Na celkweek onder adequate omstandigheden, Iwayama et al. observeerde de cellen met SE-ADM om normale intracellulaire structuren te identificeren. De wetenschappers observeerden dat MV's zich aanpasten aan collageenfibrillen na 4 tot 10 dagen celgroei in osteogene media en dat de uitgescheiden deeltjesgrootte toenam als gevolg van fusie of deeltjesgroei, met hun afmetingen in overeenstemming met eerdere rapporten om te suggereren dat het inderdaad MV's waren.

Bij nader onderzoek met SE-ADM, ze merkten de betrokkenheid op van de lysosomale route om intraluminale MV's te transporteren en uit te scheiden in een soortgelijk proces als exosomen. interessant, zowel exosomen als MV's worden gecategoriseerd als extracellulaire blaasjes met vergelijkbare afmetingen; ze worden beide uitgescheiden door osteoblasten en hebben gedeelde functies tijdens cel-celcommunicatie.

In de volgende stap, Iwayama et al. onderzocht of deze deeltjes MV's waren die calcium en/of fosfaat bevatten. Voor deze, ze kweekten de cellen gedurende 7 dagen in osteogene media en observeerden ze met SE-ADM om zeer gladde structuren zonder kristalfacetten vast te leggen. Dit suggereerde dat de MV's niet kristalliseerden maar amorf bleven, zoals ook werd vastgelegd in een eerdere studie. Toen de wetenschappers de MV's op een SiN-film (siliciummononitride) onderzochten, ze observeerden scherpe pieken die overeenkomen met fosfor, calcium, koolstof- en zuurstofelementen. Ze bevestigden de bevindingen met behulp van Raman-spectroscopie om de aanwezigheid van calciumfosfaat in MV's aan te tonen.

De wetenschappers onderzochten ook de effecten van hypofosfatasie, een medische aandoening die wordt gecodeerd door de Alpl (alkalische fosfatase) gen , waarbij osteoblasten in vitro geen mineralisatie ondergaan. Voor deze, ze bewerkten het genoom van osteoblastcellen met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie voor het bewerken van het genoom om Alpl-knock-out-osteoblastklonen te genereren. Toen Iwayama et al. onderzocht de knock-out-klonen met SE-ADM met hoge resolutie, ze hebben geen MV's waargenomen, wat verder werd bevestigd met behulp van spectrometrische analyse vanwege de afwezigheid van fosfor- en calciumpieken.

Na het direct observeren van de productie en secretie van MV's met SE-ADM, de wetenschappers onderzochten verder de betrokkenheid van lysosomen bij intracellulaire handel in MV's om levende osteoblastmineralisatie te observeren. Ze kweekten de cellen in calciumbevattende osteogene media en kleurden ze met LysoTracker om de intracellulaire componenten van belang te detecteren. Iwayama et al. lokaliseerde de met calceïne vervulde blaasjes die overeenkwamen met lysosomen om de biogenese van MV's in lysosomen te suggereren na hun fusie met calceïne ⁺ blaasjes. De wetenschappers volgden de experimenten met onderzoek naar functieverlies en functionele remming om de routes verder te deconstrueren en intracellulaire werkingsmechanismen tijdens mineralisatie van levende cellen in vitro te onderzoeken.

Scientists had previously reported the involvement of mitochondria during mineralization due to the presence of electron-dense calcium and phosphorous-rich granules in osteoblast mitochondria. This was observed with a modified cryotechnique. Verder, reports also suggest the direct contact of lysosomes and mitochondria with functional significance. When Iwayama et al. stained cells with LysoTracker together with MitoTracker and observed the intracellular components under N-SIM structured illumination super-resolution microscopy (SRM). They observed the presence of most calcein-fulfilled vesicles next to mitochondria and matched with lysosomes. During SRM-time lapse imaging, the scientists further obtained views of intracellular transport of LysoTracker containing vesicles fused to static calcein vacuoles adjacent to mitochondria to validate their hypothesis.

Op deze manier, together with observations of other SRM systems and additional cell lines, Tomoaki Iwayama and colleagues proposed a mineralization mechanism. Wherein lysosomes played a central role in intracellular MV biogenesis and trafficking within osteoblasts. It was reasonable to involve lysosomes for osteoblasts to transport amorphous calcium phosphate without crystallization during its transport in the cytosol. The scientists aim to conduct further experiments to understand the regulatory molecules for MVs and investigate if MVs and exosomes have similar constitutions and mechanism underlying their generation, secretion and function. The SE-ADM strategy used in the present work can be installed into existing scanning electron microscopy apparatus at a low cost. The work developed in the study will offer non-invasive, high-resolution imaging at the nanoscale applicable to all scientific fields.

© 2019 Wetenschap X Netwerk